二维聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种基于电荷和分子量分离复杂蛋白质混合物中蛋白质的分析技术

摘要

来源：Zhan, X., 等. 二维凝胶电泳联合质谱法分析人垂体腺瘤组织蛋白质组 J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们演示了一种二维凝胶电泳方法，该方法可从人无功能性垂体腺瘤（NFPA）的肿瘤组织中获得的复杂蛋白质混合物中分离出单个蛋白质。蛋白质首先在第一维中根据其电荷进行分离，然后在第二维中根据其分子量进一步分离。

方案

1. 样品制备

1. 从神经外科部门收集垂体腺瘤组织（0.2 - 0.5 mg）。立即用液氮速冻，随后转移至 -80 °C 保存。
2. 在去离子蒸馏水（ddH₂O）中加入 2 mL 0.9% NaCl 溶液。用此溶液轻轻冲洗组织表面的血液（3 次）。
   注意：本实验方案中使用的 ddH₂O 电导率为 18.2 MΩ/cm。在清洗组织表面血液时，可能会损失部分组织。
3. 每 0.5 - 0.6 g 组织加入 10 mL（4 °C）含 2 M 乙酸和 0.1%（v/v）β-巯基乙醇的溶液，使用组织匀浆器匀浆（1 分钟，13,000 rpm，4 °C，重复 10 次），将匀浆液超声处理 20 秒，冻干后于 −80 °C 保存。
4. 使用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒测定冻干匀浆样品的蛋白含量。
   注意：BCA 定量并非绝对定量，测定结果会因操作人员和实验试剂的不同而有所变化。不同实验应使用固定浓度的样品作为标准。因此，每块二维凝胶上样蛋白量的最终确定应依据预实验中银染或考马斯亮蓝染色后获得的高分辨率图像。
   1. 将约 300 μg 冻干匀浆样品加入一体积（282 μL）蛋白提取缓冲液（8 M 尿素和 4% CHAPS）中，静置 2 小时，水浴超声 5 分钟，旋转混匀 1 小时，再次水....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ettan IPGphor 3	GE Healthcare		等电聚焦系统。
Ettan DALT II System	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		垂直电泳系统
Ettan IPGphor strip holder	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		多胶灌注模具
KimWipe	Kimvipe		不溶性纸巾
Water	Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer	Brinkmann Instruments, Westbury, NY
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
2-D Quant Kit	GE Healthcare	80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE	AMRESCO	0172
ACRYLAMIDE	AMRESCO	0341
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Urea	VETEC	V900119
SDS	AMRESCO	0227
CHAPS	AMRESCO	0465
TEMED	AMRESCO	M146
Ammonium Persulfate	AMRESCO	M133
IPG buffer pH 3-10, NL	GE Healthcare	17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL, 18cm	GE Healthcare	17-1235-01