二维聚丙烯酰胺凝胶电泳：一种基于电荷和分子量分离复杂蛋白质混合物中蛋白质的分析技术

摘要

来源：Zhan, X., 等. 二维凝胶电泳联合质谱法分析人垂体腺瘤组织蛋白质组 J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们演示了一种二维凝胶电泳方法，该方法可从人无功能性垂体腺瘤（NFPA）的肿瘤组织中获得的复杂蛋白质混合物中分离出单个蛋白质。蛋白质首先在第一维中根据其电荷进行分离，然后在第二维中根据其分子量进一步分离。

方案

1. 样品制备

1. 从神经外科部门收集垂体腺瘤组织（0.2 - 0.5 mg）。立即用液氮速冻，随后转移至 -80 °C 保存。
2. 在去离子蒸馏水（ddH₂O）中加入 2 mL 0.9% NaCl 溶液。用此溶液轻轻冲洗组织表面的血液（3 次）。
   注意：本实验方案中使用的 ddH₂O 电导率为 18.2 MΩ/cm。在清洗组织表面血液时，可能会损失部分组织。
3. 每 0.5 - 0.6 g 组织加入 10 mL（4 °C）含 2 M 乙酸和 0.1%（v/v）β-巯基乙醇的溶液，使用组织匀浆器匀浆（1 分钟，13,000 rpm，4 °C，重复 10 次），将匀浆液超声处理 20 秒，冻干后于 −80 °C 保存。
4. 使用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒测定冻干匀浆样品的蛋白含量。
   注意：BCA 定量并非绝对定量，测定结果会因操作人员和实验试剂的不同而有所变化。不同实验应使用固定浓度的样品作为标准。因此，每块二维凝胶上样蛋白量的最终确定应依据预实验中银染或考马斯亮蓝染色后获得的高分辨率图像。
   1. 将约 300 μg 冻干匀浆样品加入一体积（282 μL）蛋白提取缓冲液（8 M 尿素和 4% CHAPS）中，静置 2 小时，水浴超声 5 分钟，旋转混匀 1 小时，再次水浴超声 5 分钟，再次旋转 1 小时，然后在 15,000 × g 离心 20 分钟。
   2. 使用商品化的 BSA 标准品（2 mg/mL）配制如下浓度的 BSA 标准溶液：0、25、125、250、500、750、1,500、2,000 μg/mL。
   3. 使用前将 BCA 试剂 A 与 B 按比例（A:B = 50:1）混合，配制成 BCA 工作液。
   4. 在微量离心管中，向 2 mL BCA 工作液中加入 0.1 mL 样品或标准溶液，混匀后于 37 °C 孵育 30 分钟，最后在室温冷却 10 分钟，测定 A_{562 nm} 处的吸光度值。
   5. 绘制标准曲线（A_{562 nm} 对 BSA 浓度），获得回归方程，用于根据样品的 A_{562 nm} 值计算其蛋白含量。
5. 对于 18 cm 固相 pH 梯度（IPG）胶条（pH 3-10 非线性，NL），银染使用相当于 150 μg 蛋白的冻干样品，考马斯亮蓝染色使用 500 μg 蛋白。
   注意：IPG 干胶条厚度为 0.5 mm，宽度为 3 mm，长度包括 7、11、13、18 和 24 cm，pH 范围包括 pH 4-5、4-7、6-9 和 3-10，可为线性或非线性 pH 梯度。所用 IPG 缓冲液必须与胶条匹配。
6. 加入 250 μL 提取缓冲液（7 M 尿素、2 M 硫脲、4%（w/v）CHAPS、100 mM DTT（使用前加入）、0.5% v/v Pharmalyte（使用前加入）以及少量溴酚蓝）。
7. 保持溶液温度低于 30 °C，涡旋振荡 5 分钟，超声 5 分钟，旋转 50 分钟。
8. 加入 110 μL 重泡胀缓冲液（7 M 尿素、2 M 硫脲、4%（w/v）CHAPS、60 mM DTT（使用前加入）、0.5% v/v IPG 缓冲液（使用前加入）以及少量溴酚蓝），超声 5 分钟，然后旋转 50 分钟，涡旋 5 分钟，在 15,000 × g 离心 20 分钟。
9. 收集上清液（350 μL）作为蛋白样品溶液。

二维凝胶电泳

1. 等电聚焦（第一维）：按照以下说明，在等电聚焦系统中进行等电聚焦。
   1. 在18厘米IPG胶条槽的加样孔中加入350 μL蛋白质样品溶液。
   2. 将18 cm IPG胶条胶面朝下放入蛋白样品溶液中（避免产生气泡）。
   3. 加入3-4 mL矿物油以覆盖IPG胶条。
   4. 将IPG胶条支架安装到等电聚焦系统中，尖端朝向背面（+）板，方形端朝向前面（−）板。
   5. 室温下复水过夜（约18小时）。
   6. 设置IEF参数：每根胶条最大电流30 μA，20 °C；250 V，1 h，125 Vh，升压并保持；1,000 V，1 h，500 Vh，梯度升压；8,000 V，1 h，4,000 Vh，梯度升压；8,000 V，4 h，32,000 Vh，升压并保持；500 V，0.5 h，250 Vh，升压并保持。总运行时间至7.5 h，累计36,875 Vh。
   7. 等电聚焦（IEF）完成后，取出每条IPG胶条，用不溶性纸巾擦去多余的矿物油。随后将胶条用塑料膜包裹，于−80 °C保存。
      注意： IPG 胶条槽应使用 IPG 胶条槽清洗液和蒸馏水进行清洗。
2. SDS-PAGE（第二维）：在垂直电泳系统中进行SDS-PAGE
   注意： 每块SDS-PAGE凝胶的尺寸应为255 × 190 × 1 mm。
   1. 使用多胶灌注装置制备12% PAGE分离胶。制备12% PAGE胶时，执行以下步骤。
      1. 加入 270 mL ddH₂O₂将150 mL 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）、180 mL 40%（w/v）丙烯酰胺/双丙烯酰胺贮存液（29:1，40% w/v 丙烯酰胺和1.38% w/v N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）、3 mL 10% 过硫酸铵和150 μL TEMED加入烧杯中配制凝胶溶液。轻轻混匀，避免产生气泡。
      2. 将凝胶溶液轻轻倒入多用制胶室，直至达到预期的凝胶高度（19 cm）。
      3. 立即加入约 3 mL ddH₂O₂在每块分离胶上加入O以覆盖凝胶。让凝胶聚合约1小时。
   2. 配制 20 L 电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘油，0.1% SDS）。用该缓冲液填充电泳分离装置的缓冲液槽。
   3. 从冰箱中取出聚焦好的IPG胶条，放入4 mL还原性平衡缓冲液（375 mM Tris-HCl (pH 8.8)、6 M尿素、2% (w/v) SDS、20% (v/v)甘油、2% (w/v) DTT（使用前加入）和少量溴酚蓝）中，室温下轻轻振荡平衡10分钟。
   4. 在4 mL烷基化平衡缓冲液（375 mM Tris-HCl (pH 8.8)、6 M尿素、2% (w/v) SDS、20% (v/v)甘油、2.5% (w/v)碘乙酰胺（使用前加入）和少量溴酚蓝）中，将还原后的IPG胶条轻轻振荡平衡10分钟。
   5. 在凝胶平衡期间，拆卸多用制胶室，取出已制备的分离胶夹心盒。用ddH₂O冲洗3次。₂O. 去除多余的 ddH₂O₂用不溶性纸巾吸干，并置于凝胶支架上。
   6. 用电泳缓冲液冲洗已平衡的IPG胶条，并用不溶性纸巾吸去IPG胶条表面多余的液体。
   7. 将IPG胶条放置于分离SDS-PAGE凝胶上，使IPG胶条的塑料面紧贴较长的玻璃板，尖端朝向左侧。
   8. 快速将3-4 mL约80 °C的1%琼脂糖SDS电泳缓冲液倒入每个SDS-PAGE凝胶顶部，以密封IPG胶条。将IPG胶条的加样面朝下置于较短的玻璃板顶部，确保无气泡产生，然后聚合10分钟。
   9. 将组装好的凝胶板垂直插入垂直电泳系统的塑料垫片之间，使带有IPG胶条的一端朝向阴极（−）。
   10. 调节电泳缓冲液的液面高度，使其浸没胶板。
   11. 连接电源/控制单元并将其设置为恒压模式，在监测染料的同时以 200 V 运行约 370 分钟。
   12. 电泳结束后，从电泳系统中取出凝胶 cassette，小心地将凝胶从凝胶 cassette 中剥离，避免撕裂凝胶，随后对双向电泳分离的蛋白质进行染色。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ettan IPGphor 3	GE Healthcare		等电聚焦系统。
Ettan DALT II System	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		垂直电泳系统
Ettan IPGphor strip holder	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA
Ettan DALTsix multigel caster	Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA		多胶灌注模具
KimWipe	Kimvipe		不溶性纸巾
Water	Made by PURELAB flex instrument
Polytron Model P710/35 homogenizer	Brinkmann Instruments, Westbury, NY
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
2-D Quant Kit	GE Healthcare	80-6483-56
BIS-ACRYLAMIDE	AMRESCO	0172
ACRYLAMIDE	AMRESCO	0341
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Urea	VETEC	V900119
SDS	AMRESCO	0227
CHAPS	AMRESCO	0465
TEMED	AMRESCO	M146
Ammonium Persulfate	AMRESCO	M133
IPG buffer pH 3-10, NL	GE Healthcare	17-6000-87
Immobiline Dry Strip pH 3-10NL, 18cm	GE Healthcare	17-1235-01