明胶酶谱电泳：一种通过检测酶活性来分析基质金属蛋白酶的电泳技术

摘要

来源：Hu, X. 等，通过酶谱法检测功能性基质金属蛋白酶。J. Vis. Exp. (2010)

本视频演示了利用明胶酶谱凝胶电泳技术检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶（MMPs）活性的方法。具有活性的MMPs可降解聚丙烯酰胺凝胶中嵌入的MMP特异性底物，在染色后背景呈深色的情况下，降解区域表现为清晰的透明条带。

方案

1. 加样并运行凝胶电泳

1. 所有样品必须经过适当处理，以保持酶的活性，并在采集后立即使用，或在 -80°C 下冷冻保存。样品中不得含有还原剂（如 β-巯基乙醇），且在上样前不得煮沸。
2. 打开含有凝胶的盒式夹层袋，用去离子水冲洗夹层。
   1. 从夹层底部移除保护胶带，并从凝胶顶部取出梳子。
   2. 用电泳缓冲液（用去离子水稀释至1X）冲洗加样孔三次。
   3. 将凝胶放入Mini-Cell中，确保夹层较小的一侧朝内。使用凝胶张紧楔固定凝胶。Mini-Cell可同时平行运行一个或两个凝胶。
   4. 向顶部（内侧）腔室加入1X电泳缓冲液，液面需高于加样孔，检查是否存在泄漏。若发现泄漏，应移除缓冲液并重新放置凝胶。
   5. 向底部腔室加入1X电泳缓冲液。
3. 在一个加样孔中加入10 μL的蛋白质分子量标记物。
   1. 将等体积的上样缓冲液与样品混合，使用上样枪头将混合物加入凝胶的加样孔中（每更换一个样品需更换新的枪头）。每个加样孔最多可加载20 μL。
4. 将盖子盖在Mini-Cell上，并将电极线连接至电源。打开电源，设定为恒压125 V，运行90分钟。观察底部腔室电极丝上是否产生微小气泡，以确认电流流通。
5. 首次运行凝胶时，应每隔15分钟监测一次迁移进程，以上样缓冲液中的溴酚蓝作为指示剂。待指示染料迁移至凝胶底部时，停止电泳。

2. 凝胶的复性与显色

1. 每块凝胶分别准备 100 mL 1× 变性缓冲液和 200 mL 变性缓冲液，均使用去离子水配制。
2. 当溴酚蓝示踪染料迁移至凝胶底部时，关闭电源，打开 Mini-Cell，取出凝胶。使用凝胶刀（或称量勺）将夹板的两面分开。切去一角以标记凝胶的方向。
3. 小心将凝胶从夹板中取出，放入盛有 100 mL 复性缓冲液的容器中。在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。
4. 弃去复性缓冲液，向凝胶中加入 100 mL 显色缓冲液。在室温下轻轻振荡孵育 30 分钟。
5. 弃去显色缓冲液，再向凝胶中加入 100 mL 新鲜显色缓冲液。于 37°C 孵育过夜（16–18 小时）。
6. 弃去显色缓冲液，在室温下用去离子水轻轻振荡洗涤三次，每次 5 分钟。
7. 扫描凝胶，记录蛋白质标准品条带的精确位置，因为这些条带在后续染色后可能变淡或不可见。
8. 向凝胶中加入 20 mL SimplyBlue Safestain 进行染色。在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。
9. 弃去 SimplyBlue SafeStain，用 100 mL 或更多去离子水在室温下轻轻振荡脱色 1 小时。
10. 为获得更佳结果，更换新鲜去离子水，在室温下继续轻轻振荡孵育 1 小时或更长时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Xcell SureLock Mini-Cell CE 标志电泳装置	Invitrogen	EI0001
电源（型号 302）	VWR	93000-744
Novex 10% 明胶zymogram凝胶，1.0 mm，12 孔	Invitrogen	EC61752BOX
Blue Juice 凝胶上样缓冲液	Invitrogen	10816015
凝胶上样吸头	VWR	53509-015
蛋白质分子量标准品	Invitrogen	LC5800
Novex Tris-甘氨酸-SDS 电泳缓冲液	Invitrogen	LC2675
Novex zymogram 复性缓冲液	Invitrogen	LC2670
Novex zymogram 显色缓冲液	Invitrogen	LC2671
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060