多分析物免疫珠检测：一种基于流式技术的免疫分析方法，用于同时检测人血清样本中的多种抗体亚型

摘要

来源：Fhied, C. L. 等，利用多指标免疫微球检测法动态监测新冠血清转化。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频介绍了一种使用荧光磁性微珠或微球的免疫分析技术，该微珠或微球偶联了不同抗原，可同时检测血清样本中的多种抗体亚型。该检测方法有助于了解感染期间或接种疫苗后的血清学转化过程。

方案

所有涉及人类受试者的研究程序均遵循机构、国家及国际人类福利指南，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 抗原偶联微球的制备

1. 选择三种不同小瓶的磁性微球，每种具有独特的微球区域，记录每个使用小瓶的微球编号（bead ID）和批号信息。
   注意： 以下步骤将针对每种不同的微球区域分别进行。微球对光敏感，应避免长时间暴露于光照下。在洗涤步骤中，注意不要扰动微球。若发生扰动，需额外静置60秒以完成分离。
2. 使用前将微球储备液涡旋振荡60秒，并超声处理5分钟，以解离聚集的微球。
3. 将1.0 × 10⁶个微球转移至1.5 mL低蛋白结合力的微量离心管中。
4. 将离心管插入磁力分离器中，静置60秒使微球分离。保持离心管仍在磁力分离器中，小心吸除上清液，避免扰动微球沉淀。
5. 从磁力分离器中取出离心管，加入100 µL高效液相色谱级水重悬微球，涡旋振荡30秒。再将离心管放回磁力分离器中静置60秒，随后吸除上清液。重复此洗涤步骤两次。
6. 从磁力分离器中取出离心管，加入90 µL 100 mM 磷酸二氢钠缓冲液（pH 6.2，活化缓冲液），涡旋振荡30秒，重悬已洗涤的微球。
7. 向微球中加入10 µL 50 mg/mL Sulfo-NHS（用活化缓冲液稀释），轻轻涡旋10秒；再加入10 µL 50 mg/mL EDC溶液（用活化缓冲液稀释），轻轻涡旋10秒。室温（RT）孵育20分钟，每10分钟轻轻涡旋混匀一次。
8. 使用50 mM MES缓冲液（pH 5.0，偶联缓冲液）代替高效液相色谱/质谱级水，重复步骤1.4–1.5，共洗涤两次。
9. 从磁力分离器中取出离心管，加入100 µL偶联缓冲液，涡旋振荡30秒重悬微球，随后立即加入所需量的目标蛋白。
10. 用偶联缓冲液将总体积调至150 µL，涡旋振荡30秒混匀偶联反应体系，在室温下旋转孵育2小时。
    注意： 本实验中所定义的检测方法采用以下蛋白浓度进行偶联：Spike S1：5 µg；核衣壳蛋白（Nucleocapsid）：5 µg；膜蛋白（Membrane）：12.5 µg。
11. 使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）-1% 小牛血清白蛋白、0.01% 吐温-20（封闭缓冲液）代替高效液相色谱/质谱级水，重复步骤1.4，共洗涤两次。将洗涤后的微球用含0.05%叠氮化钠的100 µL封闭缓冲液重悬，涡旋振荡30秒。
    注意： 在进行后续任何操作前，应让微球在封闭缓冲液中充分封闭至少6小时。
12. 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对回收的微球数量进行计数，并记录观察到的微球浓度。
13. 将偶联完成的微球置于4 °C避光冷藏保存。

2. 实验步骤

1. 检测性能（基础方案）
   1. 涡旋重悬偶联微球30秒，随后超声处理约60至90秒。
   2. 从各自的管中取出所需量的每种珠胶体，并将珠胶体混合至一个新的1.5 mL微量离心管中。
   3. 将试管放入磁力架中，静置分离60秒。保持试管仍在磁力架中，小心移除上清液，避免扰动磁珠沉淀。
   4. 将珠子从磁力架上取下，加入100 µL含1%牛血清白蛋白和0.01%聚山梨酯-20的磷酸盐缓冲液（检测缓冲液），涡旋振荡30秒。将离心管放入磁力架中，静置60秒使珠子分离。重复此洗涤程序（即 步骤 2.1.3-2.1.4两次。
   5. 通过加入适量的检测缓冲液，调整3重工作微球混合物的浓度，使每种目标微球的最终浓度为每1 µL含100个微球。
   6. 取12.5 µL已制备的微球混合液 步骤 2.1.5 加入384孔板的每孔10 µL，或96孔板的每孔25 µL。
   7. 将血浆/血清样本用测定缓冲液稀释500倍。根据所需滴定度配制标准样本。
   8. 向384孔样本板的每个指定孔中加入12.5 µL测定缓冲液作为空白样品，并将各稀释后的样本或标准品加入相应孔中；或向96孔样本板的每个孔中加入25 µL空白、稀释后的样本或标准品。
   9. 用铝封膜或铝箔覆盖酶标板，在室温下以700 rpm于板式摇床孵育1小时。
      注意： 稀释曲线的示意图如下所示 表1.
   10. 用测定缓冲液（Assay Buffer）配制抗人检测抗体（二抗溶液），浓度为 4 µg/mL，具体操作如下文所述。 步骤 2.1.11.
   11. 制备山羊抗人 IgM 与超级亮蓝 436（SB）偶联物/山羊抗人 IgA 与藻红蛋白（PE）偶联物的检测抗体，浓度为 4 µg/mL；或制备山羊抗人 IgM 与 SB 偶联物/山羊抗人 IgG 与 PE 偶联物的检测抗体，浓度为 4 µg/mL。
       注意： 对于384孔板，每孔需要12.5 µL的制备好的二抗溶液；对于96孔板，每孔需要25 µL。
   12. 将培养板置于磁力架上，快速洗涤，然后用力倒置在生物危害容器上以去除孔中的液体。保持培养板倒置，用力将其在一团厚纸巾上敲击。
   13. 用 100 µL 检测缓冲液洗涤每孔，并用力将液体倒置于生物危害容器中弃去，操作步骤同前。重复这些步骤（2.1.12-2.1.13）共洗涤两次。将所有使用过的纸巾丢弃至生物危害容器中。
   14. 向384孔板的每孔中加入12.5 µL二抗工作液，或向96孔板的每孔中加入25 µL。用铝箔封板膜或铝箔覆盖板孔，在700 rpm的板式摇床上室温孵育30分钟。
   15. 重复洗涤 步骤 2.1.12-2.1.13.
   16. 向384孔板的每个孔中加入75 µL测定缓冲液，或向96孔板的每个孔中加入100 µL测定缓冲液。用铝封膜或铝箔覆盖板孔，在700 rpm的平板摇床中室温孵育5分钟。
   17. 根据系统手册，使用仪器分析仪分析60 µL样本。

表1：标准曲线的稀释系列：用于IgG血清型标准曲线的稀释倍数表；以7个点、1:5倍比连续稀释曲线形式呈现，起始浓度分别为α-刺突蛋白S1和α-核衣壳抗体1 µg/mL，α-膜蛋白抗体5 µg/mL。

标准编号	稀释系列	抗S1或N蛋白（µg/mL）	抗膜蛋白（µg/mL）
空白	空白	-	-
1	STD7 1:1	1	5
2	STD6 1:5	0.2	1
3	STD5 1:25	0.04	0.2
4	STD4 1:125	0.008	0.04
5	STD3 1:625	0.0016	0.008
6	STD2 1:3125	0.00032	0.0016
7	STD1 1:15625	0.000064	0.00032

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
384孔黑色侧边聚苯乙烯微孔板	Thermo Fisher	12-565-346
活化缓冲液（0.1 M NaH2PO4，pH 6.2）	自行配制
检测缓冲液（PBS，1% 牛血清白蛋白，0.01% 吐温-20）	自行配制
牛血清白蛋白，热休克组分	MilliporeSigma	A-7888-50G
偶联缓冲液（50 mM MES，pH 5.0）	自行配制
新型冠状病毒（COVID-19 M Coronavirus）重组基质蛋白（6xHis标签）	MyBioSource	MBS8574735
一次性移液器吸头
EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐）	Thermo Fisher	PIA35391
山羊白蛋白，V组分粉末	Millipore Sigma	A2514-1G
山羊抗人IgA，R-PE标记，多克隆抗体	Thermo Fisher	OB205009
山羊抗人IgG，R-PE标记，多克隆抗体	Thermo Fisher	OB204009
山羊抗兔IgG，R-PE标记，多克隆抗体	Thermo Fisher	OB403009
山羊抗人IgM，R-PE标记，多克隆抗体	Thermo Fisher	OB202009
小鼠抗人IgM，SB 436标记，克隆号 SA-DA4	Thermo Fisher	62999842
仪器分析仪	Luminex Corp.	INTELLIFLEX-RUO
低吸附微量离心管（1.5 mL）	Thermo Fisher	13-698-794
MagPlex-C 微球，区域 XXX	Luminex Corp.	MC10XXX-01
MES 水合物（2-(N-吗啉)乙烷磺酸水合物）	MilliporeSigma	M2933
微孔板铝封膜	Thermo Fisher	07-200-683
吐温-20	Thermo Fisher	BP337-500
Quality Biological Inc. PBS，pH 7.2	Thermo Fisher	50-751-7328
封闭缓冲液（PBS，1% 山羊血清白蛋白，0.01% 吐温-20）	自行配制
SARS-CoV-2（2019-nCoV）核衣壳蛋白（His标签）	Sino Biologicals	40588-V08B
SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白（S1亚基，His标签）	Sino Biologicals	40591-V08H
SARS-CoV-2（2019-nCoV）刺突蛋白RBD抗体，兔多克隆抗体	Sino Biologicals	40592-T62
SARS-CoV-2（2019-nCoV）核衣壳抗体，兔单克隆抗体	Sino Biologicals	40588-R0004
SARS-CoV-2（COVID-19）膜蛋白抗体（IN），兔多克隆抗体	ProSci	10-516
Sulfo-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠）	Thermo Fisher	PIA39269
洗涤缓冲液（PBS，0.01% 吐温-20）	自行配制
水，LC/MS级	Thermo Fisher	W-64