磷脂酶活性检测：一种凝胶扩散法测定 Anthopleura dowii 粗毒提取物中磷脂酶活性的方法

摘要

来源：Ramírez-Carreto, S., 等，通过简易生物测定法鉴定海葵粗提物中的溶血和磷脂酶活性。J. Vis. Exp. (2022)

在本视频中，我们演示了一种检测海洋海葵Anthopleura dowii粗毒提取物中磷脂酶存在的实验方法。该实验采用琼脂糖凝胶扩散技术，其中磷脂酶在固体培养基中呈放射状扩散并降解其中掺入的磷脂。

方案

1. 生物体采集

1. 采集海葵 A. dowii。
   注意：此处，生物样本在墨西哥下加利福尼亚州恩塞纳达海岸潮间带的退潮期间采集（图 1A, B）。
2. 将生物样本置于盛有海水的容器中运输至实验室（图 1C）。
3. 在实验室中，用手以蒸馏水清洗生物样本，去除附着在体表的大颗粒基质物质。
4. 立即将生物样本在超低温冰箱中 -80 °C 下速冻，保存 72 小时。
5. 将生物样本放入专用玻璃容器中进行冻干，冻干条件为 -20 °C、0.015 psi，持续 48 小时。
6. 将冻干后的生物样本于 -20 °C 保存，待用。

2. 组织水化

1. 用 60 mL（1/3 w/v）50 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.5）和 1 片蛋白酶抑制剂混合片（材料表）重悬 20 g 干重的冻干菌体。
2. 在磁力搅拌器上，于 4 °C 条件下以约 800 rpm 持续搅拌样品 12 小时。

3. 毒素释放

1. 为诱导细胞裂解和刺丝囊排放，将样品在 -20 °C 下冷冻 12 小时，然后将容器置于室温（RT）水中，直至样品解冻至约 90%。重复此操作三次。
   注意：样品无需完全解冻至 100%；关键是要将样品维持在约 4 °C，以防止蛋白质降解。
2. 在共聚焦显微镜下观察刺丝囊的排放情况。取 10 µL 样品置于载玻片上，盖上盖玻片，在 100 倍和 60 倍放大倍数下用共聚焦显微镜观察。此处无需使用染料。
3. 使用 ImageJ 软件（版本 1.53c，Wayne Rasband，美国国立卫生研究院，USA，https://imagej.nih.gov/ij）处理共聚焦显微镜采集的图像。
4. 若刺丝囊内部的管状结构已解旋并伸出囊外，则表明刺丝囊已排放，可继续进行下一步操作；否则，仅再进行一次冻融循环。
5. 为澄清提取物，将样品在 4 °C 条件下以 25,400 × g 离心 40 分钟，收集上清液后再次离心。重复此步骤 3–4 次。
6. 收集上清液并弃去沉淀。上清液或粗提物中含有毒液成分（毒素）及其他细胞分子，如脂质、碳水化合物和核酸。

4. 总蛋白定量

1. 使用商用 Bradford 比色法试剂盒（材料表）测定粗提物的蛋白质浓度。
2. 将染料试剂稀释（1 份染料加 4 份蒸馏水）。
3. 用磷酸盐缓冲液（50 mM 磷酸钠，pH 7.5）配制牛血清白蛋白（BSA）第五组分（材料表）溶液，浓度为 1 mg/mL。
4. 按照 表 1 所列溶液，每种制备三份。
5. 在振荡器上剧烈振荡混合每种溶液，持续 4 秒。
6. 在室温下静置孵育样品 5 分钟，不振荡。
7. 在 595 nm 处测定吸光度（AU）。
8. 绘制样品 BSA 吸光度平均值的曲线（AU 对蛋白质浓度），并确定曲线方程（公式 1）。
   
   其中 y 为吸光度，m 为直线斜率，x 为蛋白质浓度，b 为 y 轴截距。计算粗提物浓度时，按如下方式求解 x：
   

5. 确定多肽毒液的复杂性

1. 根据说明书组装用于垂直凝胶电泳的玻璃容器。
2. 配制丙烯酰胺混合液（30%）：29.2 g 丙烯酰胺，0.8 g 双丙烯酰胺，加水至终体积为 100 mL。使用 0.45 µm 滤膜过滤溶液。将溶液储存于避光瓶中，4 °C 保存。然后，按照 表 2 中的配方配制分离胶混合液。
3. SDS-PAGE 凝胶由分离胶和浓缩胶组成。根据 表 2 中规定的溶液体积配制凝胶。在配制过程中，应将各混合液保持在 4 °C，以缩短聚合时间。
   注意： 每种混合液的体积因所用设备品牌而异；本实验方案中的体积适用于制备厚度为 0.75 mm 的 15% 丙烯酰胺凝胶，用于垂直电泳槽（材料表）。
4. 待丙烯酰胺聚合完全（约 10 分钟）后，加入浓缩胶混合液。
5. 配制浓缩胶混合液后，立即倒入玻璃板之间，并插入梳子以形成加样孔。
6. 待浓缩胶聚合完成后（约 15 分钟），取出梳子，并将玻璃容器放入垂直电泳槽中。
7. 向电泳槽中加入 200 mL 电极缓冲液（0.25 M Tris，0.192 M 甘氨酸，0.1% SDS）。
8. 分析粗提物：将 30 µg 粗提物与 5 µL 蛋白上样缓冲液（25% 甘油、15% 十二烷基硫酸钠、25% 2-巯基乙醇、0.125 mM Tris pH 7，溴酚蓝 0.1 mg/mL）混合，以变性蛋白质。最终体积必须 <50 µL。
9. 在 90 °C 加热 5 分钟，冷却后于 1,400 x g 离心 3 秒。10. 将样品加入浓缩胶的加样孔中，并加入标准分子量蛋白 Marker。
10. 将样品加入浓缩胶的加样孔中，并加入标准分子量蛋白 Marker。
11. 以 25 mA 恒流电泳 1 小时 30 分钟。
12. 从电泳槽中取出玻璃容器，进行凝胶蛋白染色。

6. 蛋白质染色

1. 用 50 mL 蒸馏水冲洗凝胶，以去除电极缓冲液中的碎屑。
2. 弃去蒸馏水。
3. 为防止凝胶中蛋白质扩散，加入固定液（60 mL 乙醇、20 mL 乙酸、20 mL 蒸馏水，终体积 100 mL），室温下以 80 rpm 振荡孵育 40 分钟，然后倾去固定液。
4. 加入蛋白质交联液（15 mL 乙醇、0.25 mL 戊二醛、50 mL 蒸馏水，终体积 65.25 mL），室温下以 80 rpm 振荡孵育 30 分钟，随后移除溶液。
5. 用 100 mL 蒸馏水洗涤凝胶 5 分钟，弃去液体，重复此步骤四次。
6. 加入 50 mL 过滤后的考马斯亮蓝 R-250 染色液（40% 甲醇、10% 乙酸、50% 蒸馏水、0.1% 染料，终体积 100 mL），在室温下以 60 rpm 在实验室旋转振荡器中搅拌染色 15 分钟。
7. 回收染色液，可重复用于其他凝胶的染色。
8. 为去除多余染料，加入脱色液（40 mL 甲醇、10 mL 乙酸、50 mL 蒸馏水），在室温下以 80 rpm 持续振荡，直至蛋白条带清晰可见。
9. 将凝胶保存于 50 mL 蒸馏水中，并在凝胶成像系统中扫描图像。

7. 磷脂酶活性测定

1. 用1% SDS的蒸馏水溶液清洗一个鸡蛋。
2. 在无菌条件下将蛋黄与蛋清分离。
3. 配制50 mL 0.86% NaCl溶液，经0.22 µm滤膜过滤。然后配制溶液A：加入12 mL卵黄和36 mL 0.86% NaCl溶液。
4. 制备溶液B：将300 mg琼脂糖溶于50 mL缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5）中，经0.22 µm滤膜过滤。用微波炉加热至沸腾。在温水中冷却至43–45°C。
5. 配制溶液C：配制10 mM CaCl2溶液，并用0.22 µm滤膜过滤。
6. 配制溶液D：将10 mg罗丹明6G溶于1 mL蒸馏水中。
7. 在无菌条件下（超净工作台中），将500 µL的A液和C液加入B液中，再加入100 µL的D液，混匀后将25 mL混合液倒入每个培养皿（90 × 15 mm）中。
8. 在无菌条件下等待溶液凝固（30 分钟）。
9. 用细管制作孔洞（直径约2-3 mm）。
10. 在一个孔中加入20 µL磷酸盐缓冲液（阴性对照），在另一孔中加入20 µL已知的磷脂酶（阳性对照）。
11. 在其余各孔中分别加入不同量的粗提蛋白提取物，即 5、15、25、35、45 µg，每孔终体积为 20 µL。
12. 等待琼脂吸附所有样品（30 分钟）。
13. 37 °C 下孵育 20 小时。
14. 若孔周围形成透明圈，则表明具有磷脂酶活性。使用游标卡尺测量透明圈的大小。
    注意： 实验重复三次（步骤7.1–7.14）。

结果

图1：海葵采集。 (A) 墨西哥南下加利福尼亚州埃尔索萨尔的潮间带区域。(B) 采集到的海葵。(C) Anthopleura dowii Verrill, 1869。

表1：通过Bradford法测定蛋白质含量。

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试管

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 锥形离心管	Corning	430766
2-溴苯酚蓝	Sigma	B75808
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
50 mL 锥形离心管	Corning	430828
冰醋酸	J.T. Baker	9515-03
丙烯酰胺	Promega	V3115
琼脂糖	Promega	V3125
双丙烯酰胺	Promega	V3143
牛血清白蛋白第五组分	Sigma	A3059-100G
Bradford 蛋白质测定试剂盒	Bio-Rad	5000006
氯化钙	Sigma-Aldrich	C3306
96 孔细胞培养板，V 型底	Corning	3894
离心机	Eppendorf	5804R
离心管	Corning	CLS430829
ChemiDoc MP 系统	Bio-Rad	1708280
柠檬酸	Sigma-Aldrich	251275
透明平底 96 孔板	Thermo Scientific	3855
考马斯亮蓝 G-250	Bio-Rad	#1610406
考马斯亮蓝 R-250	Bio-Rad	1610400
葡萄糖	J.T. Baker	1916-01
无管通风柜	Labconco	Vertical	https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Gel Doc EZ	Bio Rad.		凝胶成像系统
甘油	Sigma-Aldrich	G5516-4L
血细胞计数板	Marienfeld	650030
ImageJ（软件）	NIH, USA	Version 1.53c
培养箱 211	Labnet	I5211 DS
甲醇	J.T. Baker	9049-03
Mini-PROTEAN 四板电泳槽	Bio-Rad	1658000EDU
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	J.T. Baker	3824-01
NaCl	J.T. Baker	3624-01
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>.H<sub>2</sub>O	J.T. Baker	3818-05
Origin 软件		version 9	用于绘制具有 S 形拟合的图表
培养皿	Falcon	351007
Pipetman 移液器套装	Gilson	F167380
预制小型凝胶	BioRad	1658004
预染蛋白质 Marker	Thermo Scientific	26620
蛋白酶抑制剂混合物	Roche	11836153001
蛋白质测定染料试剂浓缩液	Bio-Rad	5000006
罗丹明 6G	Sigma-Aldrich	252433
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
二水合柠檬酸钠	JT Baker	3646-01
分光光度计	THERMO SCIENTIFIC	G10S UV-VIS
Tris 碱	Sigma-Aldrich	77-86-1
电压电源	Hoefer	PS300B