环形微图案细胞手性检测法：一种基于环形微图案上细胞排列的多细胞手性体外检测技术

摘要

来源：Zhang, H. 等 一种用于测量细胞手性的微图形化检测方法。J. Vis. Exp. (2022)

在本视频中，我们介绍了一种细胞手性检测方法，用于确定细胞在受限几何边界（如环形微图案）中的排列偏向性。手性是大多数细胞类型的固有特性，由遗传和环境因素共同决定。了解正常细胞群体的手性有助于筛选经药物处理的细胞。

方案

1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章的制备

1. 使用CAD软件绘制微尺度环阵列，内径为250 µm，外径为450 µm。本方案所用图案为10 × 10阵列，环与环之间的间距为850 µm。
2. 使用微加工公司的掩模打印服务，按所需分辨率打印图案的透明掩模（参见 材料表).
   注意： 已证实，所提供的环形尺寸适用于多种细胞类型。
3. 使用含有目标特征的掩膜进行紫外光（UV）光刻，以制备负性光刻胶模具（如 SU-8）。
   1. 将制备好的透明掩模覆盖在涂有光刻胶的硅片上 步骤 1.1–1.2.
   2. 在紫外光接触式光刻机上，通过紫外光照射掩模的透明区域，使光刻胶发生聚合。
      注意： 经过进一步清洗和显影后，具有目标特征的主模具即制备完成。具体操作细节取决于所使用的特定设备。
4. 将PDMS弹性预聚物与其固化剂按10:1的比例混合，制备预聚物混合物，随后将该混合物浇注至培养皿中的模具内。
5. 将培养皿置于真空室中30分钟，以去除PDMS中的气泡，随后在60 °C的烘箱中烘烤至少2小时。
6. PDMS完全固化后，将图案阵列切割成印章。
   注意： 较厚的印章（约1 cm）可能更适用于微接触印刷后续步骤中的操作，因其更易于处理。

2. 玻璃载玻片的包被

1. 清洁载玻片。将载玻片浸入100%乙醇溶液中，超声处理5 min，然后用水冲洗。
2. 先用丙酮重复此步骤，然后用异丙醇，最后在氮气流中干燥。
3. 使用电子束（E-beam）蒸发设备在玻璃载片上镀钛和金层。
   注意： 钛层的所需厚度为15 Å（1 Å = 10-10 m），金层的所需厚度为150 Å。先沉积钛层，再沉积金层，因为钛层可作为金与玻璃载片之间的粘附层。
4. 将清洗后的载玻片放入蒸发室内，并在快门下方插入金和钛坩埚。
5. 将腔室抽真空至低于10-5 Pa后，再熔化金属。将电子束聚焦于金属表面，并调节功率，使沉积速率适宜以控制沉积厚度。
6. 打开快门以开始金属沉积。当达到所需厚度时，关闭快门。
7. 在两种金属的顺序蒸发过程中切换坩埚。
8. 等待坩埚按设备要求冷却后，释放腔室压力，取出镀金玻璃载片。
9. 再次抽空腔室以进行设备维护。
   注意： 具体操作细节可能因特定的电子束蒸发仪而异。控制钛的沉积速率，保持较低的沉积速度至关重要。过厚的钛层常会导致可视性变差，尤其影响细胞的荧光成像效果。镀膜完成后，钛/金镀层玻璃载片可于室温下存放在干燥的真空容器中，至少可保存1个月。

3. 微接触印刷

1. 可根据需要将镀钛/金的载玻片切割成较小的片状。典型应用推荐使用 12 mm × 12 mm 的正方形（图1B）。
2. 使用玻璃切割刀在表面划出凹痕轨迹，然后双手握住载玻片两侧，在凹痕处弯折使其断裂为小块。避免触碰镀金表面。
   注意： 若不慎将载玻片翻转，可通过比较两侧光线反射情况来判断哪一侧为镀层表面。镀金面反射更明亮，而未镀层侧（玻璃另一侧的钛层）反射较暗。另一种方法是观察载玻片边缘，从垂直切割面可判断出镀层所在侧。
3. 将载玻片放入培养皿中，金面朝上，用100%乙醇浸泡，并在摇床上振荡清洗至少10分钟。吸除乙醇后，用氮气流吹干每片载玻片。
4. 用肥皂水清洗PDMS印章，再用100%乙醇冲洗，最后用氮气吹干。
5. 通过将5.74 mg C18粉末溶于10 mL 100%乙醇中，配制2 mM十八烷硫醇（C18）溶液。
   注意： C18溶液应密封并在室温下保存。使用C18进行图案化打印可形成具有黏附性的自组装单分子层，有利于纤连蛋白和细胞的选择性附着。
6. 将PDMS印章图案面向下浸入C18溶液中10秒，随后用氮气轻柔吹干60秒。
   注意： 干燥时，先将气流保持在远离印章的位置（约1米远），待大部分液体蒸发后，再缓慢靠近以彻底干燥印章。此举可防止C18溶液被气流吹走而未能在印章表面干燥。
7. 将印章面朝下贴合到金载玻片上，保持60秒后取下。
8. 为确保压印效果良好，可用镊子轻轻敲击印章表面，以促进图案完整转移。切勿用力下压，通常镊子自身重量已足够。
   注意： 压印过程中目视观察可确认印章与玻璃载玻片是否均匀接触。
9. 准备湿度培养室。
   1. 向倒置的培养皿盖中加入1 mL 70%乙醇，铺上一片Parafilm膜覆盖表面（膜面朝上）。
   2. 用镊子提起并铺设Parafilm膜，确保无气泡产生，必要时去除多余乙醇。
10. 配制2 mM HS-(CH2)11-EG3-OH（EG3）溶液：将5 µL原液稀释至5 mL 100%乙醇中。
    注意： 稀释后的EG3溶液可密封后于4 °C保存；未稀释的EG3原液应保存于-20 °C。EG3处理用于使未修饰C18的玻璃区域对细胞呈非黏附性。
11. 在湿度培养室的Parafilm膜上，为每块四分之一大小的载玻片滴加40 µL EG3溶液，各液滴之间留出足够间距，以匹配金载玻片的排列间隔。
12. 用镊子将已打印C18的金载玻片面朝下放置于液滴上，确保载玻片下无气泡。轻推载玻片使其靠拢，但不要抬起，以减少蒸发。
    注意： 先将载玻片一端靠近液滴处放下，再缓慢放下另一端。若出现气泡，可在不抬起载玻片的情况下推动其移动，直至气泡消失。
13. 用Parafilm膜将培养皿密封严实，在室温下静置至少3小时。
    注意： 若需延长孵育时间，可双重密封培养皿并静置最长24小时。
14. 在生物安全柜中，将金载玻片面朝上放入培养皿，用70%乙醇浸泡并冲洗3次以去除EG3，随后在乙醇中继续浸泡10分钟以完成灭菌。
15. 吸除乙醇，替换为无菌PBS缓冲液。
16. 按照步骤3.9所述方法准备另一个湿度培养室，但使用PBS代替乙醇。
    注意： 由于表面张力差异，建议先加入4–5 mL PBS以铺设Parafilm膜并排除气泡，之后吸除多余液体。
17. 在无菌PBS中配制50 µg/mL纤连蛋白溶液（如需要，也可使用其他蛋白），并在湿度培养室的Parafilm膜上为每块四分之一载玻片滴加50 µL纤连蛋白溶液，各液滴间留出适当间距。
    注意： 纤连蛋白包被有助于细胞在图案化表面的黏附。
18. 使用晶圆镊子将载玻片面朝下放置于液滴上，确保载玻片下无气泡。轻推载玻片使其靠拢，但不要抬起。
    注意： 推荐使用直头宽尖的玻璃载玻片镊子或晶圆镊子来操作载玻片。
19. 将培养皿置于生物安全柜中静置30分钟。
20. 30分钟后，将金载玻片经三次冲洗后，面朝上置于PBS中。
    注意： 经纤连蛋白图案化的载玻片可在PBS中于4 °C保存约一个月。

4. 将细胞接种到微图案化载玻片上

1. 将细胞培养基和胰蛋白酶在 37 °C 水浴中预热。
   注意：以下传代培养的描述针对 NIH/3T3 细胞。不同细胞类型的培养条件可能有所不同。
2. （可选）将图案化载玻片浸泡于 12 孔板中的培养基中，在细胞进行胰蛋白酶消化前，将其置于培养箱中预热至 37 °C，以促进细胞更好地贴附。
3. 用胰蛋白酶消化细胞，加入含 FBS 的培养基中和，以 100 × g 离心 3 分钟，然后用新鲜培养基充分混匀重悬细胞。
   注意：确保细胞已完全解离，彼此分开。
4. 计数细胞，调整浓度至 200,000 个细胞/mL，并向每孔中含金载玻片的孔加入 0.5 mL 细胞悬液。
5. 轻轻振荡培养板数次以实现均匀接种，随后将培养板放入培养箱中孵育 15 分钟，使细胞贴附。
6. 15 分钟后，在显微镜下检查细胞贴附情况；如需要，可延长孵育时间。
   注意：已贴附的细胞会在表面铺展，可见丝状伪足或变扁平，当轻轻敲击或移动培养板时，细胞不会从表面移动。
7. 吸除各孔中含未贴附细胞的培养基，每孔加入 1 mL 新鲜培养基。如需进行药物处理，可在该步骤向培养基中添加相应的试剂。
8. 将细胞在培养箱中继续培养 24 小时，观察汇合度以判断是否形成手性结构。
   注意：大多数细胞类型建议汇合度超过 75%；过度汇合可能影响手性特征的观察与表征。

5. 图像采集

1. 细胞达到汇合时进行固定。
   1. 移除培养板中的培养基，并用 PBS 洗涤一次。
   2. 加入 4% 多聚甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
      注意：如果固定过程显著改变细胞形态，建议在固定前进行成像
2. 使用带相机功能的相差显微镜，以高分辨率对载玻片上的每个环进行成像（10x 物镜已足以用于分析）。

6. 细胞手性表征（图 2）

1. 下载用于手性表征的 MATLAB 代码文件。
2. 将代码文件夹及其子文件夹（包含圆形统计工具箱）添加到 MATLAB 路径中，并打开“ROI_selection.m”文件。在第 4 行中，将目录更改为所需的数据文件夹（对于 Windows 用户，在第 4 和第 5 行中将“/”更改为“\”）。
3. 在第 14 行中更改图像尺寸，前两个数值表示环的内圆尺寸，后两个数值表示外圆尺寸。
   注意：确保待分析文件夹中所有图像的尺寸完全相同。
4. 点击运行按钮，执行 MATLAB 代码“ROI_selection.m”，以确定相差图像中的感兴趣区域（ROI）。
5. 手动拖动选择框以适配环状结构，然后在图像上双击以确认选择。
6. 对文件夹中的每张图像重复此步骤（确认前一张图像的 ROI 选择后，下一张图像将自动弹出）；每个图像将生成一个“.mat”文件，用于存储其 ROI 信息。
7. 打开“Analysis_batch.m”文件，并将文件夹目录更改为与步骤 6.2 相同的路径（对于 Windows 用户，首次使用时，请在第 5、6、124 和 130 行中将“/”更改为“\”）。
8. 点击运行按钮，执行代码“Analysis_batch.m”，以确定多个细胞环状模式的手性。将生成一个“datatoexcel.txt”文件，其中包含每个环的圆形统计结果，以及顺时针、非手性和逆时针环的数量。

结果

图1. 细胞微图案化的示意图。 (A) 用于细胞图案化的微加工与微接触印刷流程。(1-2) 通过含有微图案特征的掩膜，利用紫外光（UV）交联光刻胶制备负性光刻胶模具。(3-4) 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体预聚物浇铸于模具上以制备印章。(5-7) 随后，将粘附性自组装单分子层（SAM）十八烷硫醇（C18）涂覆于印章表面，并通过微接触印刷将其转移至金镀玻璃载片上。(8) 接着涂覆非粘附性乙二醇端基自组装单分子层HS-(CH2)11-EG3（EG3），以及纤连蛋白（fibronectin）。(9) 随后接种细胞，使其附着于图案区域。(10) (B) 照片展示了细胞微图案化过程中的关键步骤...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
200 proof 乙醇	Koptec	DSP-MD-43
BZX 显微镜系统	Keyence	BZX-600
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），高糖	Gibco	11965092
电子束蒸发仪	Temscal	BJD-1800	金-钛薄膜镀膜
胎牛血清	VWR	89510-186
牛血浆来源纤连蛋白	Sigma	F1141-5MG
玻璃显微镜载玻片	VWR	10024-048
玻璃镊子	Exelta	390BSAPI
金蒸发颗粒	International Advanced Materials	AU18
HS-(CH2)11-EG3-OH（EG3）	Prochimia	TH 001-m11.n3-0.2
MATLAB	Mathworks	MATLAB_R2020b
NIH/3T3 细胞	ATCC	CRL-1658
OAI 接触式光刻对准仪	OAI	200	紫外光刻
十八烷硫醇（C18）	Sigma	O1858-25ML
旋转摇床	VWR	89032-088
磷酸盐缓冲液（PBS）	Research product international	P32080-100T
聚二甲基硅氧烷 Sylgard 184	Dow Corning	DC4019862
硅晶圆	University Wafer	ID#809
丙酮酸钠	Thermo fisher scientific	11360-070
SU-8 3050 光刻胶	MicroChem	Y311075 0500L1GL
钛蒸发颗粒	International Advanced Materials	TI14
透明掩模（带特征图案）	Outputicity.com	N/A	掩模打印服务
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Thermo fisher scientific	25200-072