细胞外囊泡摄取测定:一种使用 3D 荧光成像技术可视化和量化细胞外囊泡摄取的方法

Abstract

来源:Kim， CJ， et al.， 通过共聚焦显微镜成像分析进行细胞外囊泡摄取测定。J. Vis. Exp. （2022 年）。

在本视频中，我们演示了一种可视化和量化细胞外囊泡或 EV 的细胞摄取的检测方法。该检测利用共聚焦显微镜的 3D 荧光成像，可以区分内化的 EV 和粘附在细胞表面的 EV。

Protocol

1. EV 分离和片上免疫荧光 EV 标记

1. 细胞培养基 （CCM） 的收集和 CCM 的预处理以进行 EV 分离
   1. 将 PC3 细胞以 30% 汇合度接种在 75 cm² 细胞培养瓶中。让对照细胞在标准培养基和细胞系特异性补充剂中生长至 90% 汇合度（~48 小时><）。 注意:为防止含 EV 的成分影响细胞摄取（即胎牛血清），请使用外泌体耗尽的培养基和补充剂。
   2. 收获 CCM。
   3. 在室温 （RT） 下以 1000 x g 离心 CCM 10 分钟，以沉淀与培养基一起收获的任何未贴壁细胞和大碎片。将上清液转移到新的锥形管中。
   4. 在新管中，将上清液在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 20 分钟，以沉淀残留在培养基中的较小碎片和凋亡小体。一些较大的 EV 会沉淀。将上清液转移到新试管中。
   5. 通过 0.45 μm 亲水性聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜注射器过滤器过滤上清液><。 注意:如果不立即处理 CCM 以进行 EV 分离，请将预处理后的 CCM 储存在 -80 °C 直至进行分离。如果冷冻，请将冻融循环限制为 1 次。
2. 使用基于纳滤的微流控器件从 CCM 中分离 EV
   1. 如果冻结，请在步骤 1.2.2 之前完全解冻 CCM 并涡旋 30 秒。
   2. 将 1 mL 预处理的 CCM（步骤 1.1）注入基于纳米过滤的微流体装置的样品室中（参见材料表><）。 注意:遵循基于纳米过滤的微流体装置的标准作程序。
   3. 在台式纺纱机中以 3000 rpm 旋转 10 分钟（参见材料表）以作微流体装置><。 注意:如果 CCM 在初始运行后仍留在样品室上，请执行其他旋转，直到所有 CCM 都从样品室中清空。
   4. 通过移液从废液室中取出液体，然后重复步骤 1.2.1、1.2.2 和 1.2.3 两次><。 注意:总共将处理 3 mL CCM 用于 EV 分离。
   5. 将 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 注入样品室以清洗分离的 EV。如步骤 1.2.3 中所述，在台式纺丝机中旋转以作微流体装置。在设备的膜上找到纯 EV。
      注意:具体来说，通过透射电子显微镜 （TEM）、扫描电子显微镜 （SEM）、纳米颗粒跟踪分析 （NTA）、结构照明显微镜、酶联免疫吸附测定和实时 PCR 证实了从基于纳米过滤的微流控装置中分离的 EV 的质量，并将其与传统的 UC 方法进行了比较在以前的研究中。
3. 使用基于纳滤的微流控装置对 EV 进行免疫荧光标记（图 1）
   1. 根据检测目的选择 EV 特异性抗体（参见材料表）
      注意:某些抗体可能会干扰 EV 摄取途径特异性的配体结合位点（即内吞作用）。
   2. 将 1 μg/mL 的 EV 特异性抗体注入含有 100 μL 分离 EV 的设备的洗脱孔中。
   3. 在 RT 下在平板振荡器上避光孵育 1 小时，以确保抗体在样品中均匀分布。
   4. 将胶带贴在洗脱孔上。将 1 mL PBS 注入样品室以洗去任何残留的抗体。
   5. 以 3000 rpm 的速度旋转设备，直到样品室为空。通过移液从废液室中去除所有液体。将 1 mL PBS 注入样品室。
      注意:荧光标记的 EV 将位于膜室中。
   将
   6. 荧光标记的 EV（图 2）从膜室移液到琥珀色管中。使用前避光。

2. 用荧光标记的 EV 孵育细胞进行 EV 摄取测定

1. 在细胞培养兼容的培养皿上进行靶向细胞接种和培养。
   1. 将 1 x 10^个 4 个 PC3 细胞接种到装有 0.2 mL 培养基的微玻片 8 孔板（每个孔 9.4 x 10.7 mm）中，或将 4 x 10^个 4 个 PC3 细胞接种到装有 1 mL 培养基的 35 mm 培养皿中。将细胞接种到由薄盖玻片（厚度:0.18 mm）组成的细胞培养皿中><。 注意:薄盖玻片最大限度地减少了光的不良散射。
   2. 让细胞在最佳细胞培养条件（37 °C，5% CO₂ 浓度，90% 湿度）中粘附过夜。
   3. 用去除外泌体的培养基洗涤粘附的细胞两次（如步骤 1.1.1 中所述）。
2. 与荧光标记的 EV 进行细胞孵育。
   1. 通过纳米颗粒跟踪分析（NTA，图 3）测量荧光标记的 EV 的浓度（步骤 1.3.5）。确定要添加到培养细胞中的荧光标记的 EV 的最佳浓度（步骤 2.1.2.）。
   2. 用去除外泌体的培养基稀释荧光标记的 EV，以匹配步骤 2.2.1 中测量的所需浓度。（即，在 200 μL 外泌体耗尽培养基中加入 7.80 x 10⁹ EV（以 NTA 值计）。
   3. 将稀释的 EV（步骤 2.2.2）添加到在 2.1.2 制备的粘附目标细胞中。孵育实验时间（即 4、8 或 12 小时）。
   4. 用无外泌体培养基洗涤细胞 3 次，以去除任何未内化的 EV><。 注意:可选:洗涤后可以固定细胞。
   5. 用 1 μg/mL 的 CMTMR（（5-（和-6）-（（4-氯甲基）苯甲酰基）氨基）四甲基罗丹明）标记粘附细胞的细胞质（参见材料表），并在最佳细胞培养条件（37 °C，5% CO₂ 浓度，90% 湿度）中孵育><。 注意:细胞面积染料应与标记的 EV 分开发出荧光，以帮助确定 EV 摄取测定过程中加标 EV 的空间位置（内化或浅表）。
   6. 用去除外泌体的培养基洗涤标记的细胞两次，以去除残留的染料。向细胞中加入新鲜的去除外泌体的培养基，为活细胞共聚焦成像做准备。

3. 共聚焦显微镜

1. 要进行活细胞成像，请使用载物台培养箱来保持最佳的细胞培养条件（37 °C，5% CO₂ 浓度，90% 湿度）。
2. 将制备好的细胞放入载物台培养箱中。
3. 根据对照样品设置成像参数。
   注意:建议的对照样品包括:仅荧光标记的 EV、荧光标记的细胞、未标记的 EV 和未标记的细胞。
4. 确定目标细胞的深度和 z 方向的堆叠尺寸范围，以获取 3D 共聚焦图像><。 注意:Z 堆栈的厚度为 1 μm。共聚焦 3D 图像采集持续 2 分 34 秒（每次 Z 平面图像采集大约需要 8 秒;总共 20 张 Z 堆栈图像）。
5. 将图像采集设置为同时细胞特异性染料（即红色）和 EV 特异性染料（即绿色）的多个 z 堆栈图像（图 4 和图 5A）。

4. 图像处理

1. 利用自动图像处理软件分析原始 z 堆叠共聚焦图像并确定细胞的 EV 摄取（参见材料表）。
2. 为细胞和 EV 特异性染料的荧光信号设置阈值参数。构建细胞的虚拟表面（图 5A、B）。
   1. 要构建单元的虚拟表面，请单击按钮 添加新表面.
   2. 选择"最短距离计算"作为"算法设置"以使用软件提供的算法，然后单击下一步:源通道。
   3. 在此实验中选择通道 2 - CMTMR 作为"源通道"。
   4. 选择 Smooth 并将适当的值放入 Surface Detail（表面细节）中以进行表面平滑。
      注意:本实验中为 0.57 μm，因为 1 个像素代表原始成像数据中的 0.57 μm。
   5. 选择 Absolute Intensity 作为 "Thresholding"。
   6. 要通过提供的算法自动对荧光图像进行阈值设置，请单击阈值（绝对强度）:该值是自动设置的。
   7. 选择启用作为"分割接触对象（区域增长）"，并将估计的细胞大小值放入"种子点直径"中，在本例中为 10.0 μm。然后单击 Next: Filter Seed Points。
   8. 要配置虚拟单元表面，请单击 + 添加按钮，然后选择质量作为"过滤器类型"。通过目视检查为下限设置适当的值（本实验中为 210），为上限设置最大值 （1485），然后单击"完成"按钮。
      注意:目视检查意味着研究人员可以将细胞区域与原始荧光图像区分开来。
   9. 接下来，要构建 EV 的虚拟点，请单击按钮 添加新点.
   10. 选择不同的光斑大小（区域增长）和最短距离计算作为"算法设置"，然后单击下一步:源通道。
   11. 在本实验中选择通道 1 - Alexa Fluor 488 作为"源通道"。
   12. 将适当的值放入"估计的 XY 直径"中进行点检测，在本例中为 1 μm。然后，单击 Next: Filter Spots（下一步:过滤点）。
   13. 要配置虚拟 EV 点，请单击 + 添加按钮，选择质量作为"过滤器类型"，并通过目视检查设置"阈值下限"，本实验中为 100。然后，单击 Next: Spot Region Type 按钮。
   14. 选择"绝对强度"作为"专色区域类型"，然后单击"下一步:专色区域"。
   15. 要阈值，EV 点的区域，通过目视检查将适当的值放入"区域阈值"中，本实验中为 100 作为"区域阈值"。
       注意:目视检查意味着研究人员可以将 EV 区域与原始荧光图像区分开来。
   16. 选择"Region Volume"（区域体积）作为"Diameter from"（直径自），然后单击 Finish（完成）。
3. 使用软件提供的算法在步骤 4.2 中分割构建表面内的分组点（图 5C，i-iv）。
   1. 单击构建的 Spots，然后进入 过滤器.
   2. 单击 + 添加 按钮，然后选择 到表面的最短距离 曲面 = 表面 1 作为 过滤器类型 ，然后单击 将选择复制到新点 按钮。下限的最低阈值（本实验中为 -7.0）和上限的适当值 （-0.5）。
      注意:使用 Spots 的估计半径设置上限。在本实验中，在步骤 4.2.11 中，将光斑（即 EV 点）的估计直径设置为 1 μm。因此，上限可以是 0.5。
4. 自动计数电池内的 EV
   注意:该软件将自动计算细胞内的 EV 数量，指示目标细胞内化的数量。
   1. 单击构建的 Lots 1 选择 [到曲面的最短距离 = 介于 -7.00 和 -0.500 之间的曲面 1]。
   2. 转到 Statistics（统计信息），然后从 "Total Number of Spots（竞价总数）"中导出值
      注意:该软件提供的算法将自动计算细胞的数量和体积。
5. 根据上述计算的值确定每个孵育期的 EV 摄取产量（图 6）。
   1. 要获得单元格的数量，请单击构建的 Surfaces 1，然后转到 Statistics，并从 Overall 导出 "Total Number of Surfaces" 的值。
   2. 转到 Detailed into Statistics 从 Detailed 导出 Volume。

Results

图 1:使用基于纳米过滤的微流体器件进行 EV 隔离和片上标记的示意图。（A） EV 与 CCM 的隔离。（B） EV 的芯片免疫荧光标记。（C） 去除未结合的抗体。

图 2:荧光标记的 EV 成像。使用共聚焦显微镜 （40x 物镜） 检测荧光标记的 （抗 CD63-Alexa Fluor 488） EV。（A） 阳性样品（抗 CD63-Alexa F...

Materials