细胞外囊泡摄取实验：利用三维荧光成像技术可视化与定量细胞摄取细胞外囊泡的方法

摘要

来源：Kim, C. J., 等, 细胞外囊泡摄取实验 通过 共聚焦显微镜成像分析 视频实验杂志 (2022).

在本视频中，我们展示了一种用于可视化并定量细胞摄取细胞外囊泡（EVs）的实验方法。该方法利用共聚焦显微镜进行三维荧光成像，能够区分被细胞内化的EVs与黏附在细胞表面的EVs。

方案

1. 细胞外囊泡的分离及芯片内免疫荧光标记

1. 细胞培养基（CCM）的收集及用于细胞外囊泡（EV）分离的CCM预处理
   1. 将PC3细胞以30%汇合度接种于75 cm²细胞培养瓶中。在标准培养基及细胞系特异性补充物中培养对照细胞至约90%汇合度（约48小时）。
      注意：为防止含EV的组分影响细胞摄取（如胎牛血清），应使用无外泌体的培养基和补充物。
   2. 收集CCM。
   3. 在室温（RT）下以1000 × g离心10分钟，沉淀随培养基收集的未贴壁细胞和大块碎片。将上清液转移至新的锥形管中。
   4. 在新管中，于4 °C下以10,000 × g离心20分钟，以沉淀培养基中残留的小碎片和凋亡小体。部分较大的EV将同时沉淀。将上清液转移至新管中。
   5. 通过0.45 µm亲水性聚偏氟乙烯（PVDF）膜针头滤器过滤上清液。
      注意：若未立即进行EV分离，应将预处理后的CCM储存于-80 °C。若已冷冻，冻融循环次数应限制为一次。
2. 使用基于纳米过滤的微流控装置从CCM中分离EV
   1. 若已冷冻，需将CCM完全解冻，并在进行步骤1.2.2前涡旋振荡30秒。
   2. 将1 mL预处理后的CCM（步骤1.1）注入基于纳米过滤的微流控装置的样品室中（参见材料表）。
      注意：请遵循基于纳米过滤的微流控装置的标准操作程序。
   3. 在台式旋转装置（参见材料表）中以3000 rpm旋转10分钟，以运行微流控装置。
      注意：若初次运行后样品室中仍有CCM残留，需重复旋转操作，直至样品室完全排空。
   4. 用移液器移除废液室中的液体，并重复步骤1.2.1、1.2.2和1.2.3两次。
      注意：总计将处理3 mL CCM用于EV分离。
   5. 向样品室中注入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS），以洗涤已分离的EV。按照步骤1.2.3所述，在台式旋转装置中旋转以运行微流控装置。EV将纯化并滞留在装置的滤膜上。
      注意：在先前研究中，通过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）、结构照明显微镜、酶联免疫吸附试验及实时PCR，已对基于纳米过滤的微流控装置所分离EV的质量进行了验证，并与传统的超速离心（UC）方法进行了比较。
3. 使用基于纳米过滤的微流控装置对EV进行免疫荧光标记（图1）
   1. 根据实验目的选择针对EV的特异性抗体（参见材料表）。
      注意：某些抗体可能干扰与EV摄取通路（如内吞作用）相关的配体结合位点。
   2. 将1 µg/mL的EV特异性抗体注入含有100 µL已分离EV的装置洗脱孔中。
   3. 在室温避光条件下，于平板摇床上孵育1小时，以确保抗体在样品中均匀分布。
   4. 在洗脱孔上贴上封口膜。向样品室中注入1 mL PBS，以洗去残留抗体。
   5. 以3000 rpm旋转装置，直至样品室排空。用移液器移除废液室中的液体。再向样品室中注入1 mL PBS。
      注意：荧光标记的EV将保留在滤膜室中。
   6. 从滤膜室中用移液器将荧光标记的EV（图2）转移至棕色管中，避光保存直至使用。

2. 细胞与荧光标记的细胞外囊泡共孵育以进行细胞外囊泡摄取检测

1. 靶细胞在细胞培养兼容培养皿中的接种与培养。
   1. 将 1 × 10⁴ 个 PC3 细胞接种至 8 孔显微培养板（每孔尺寸为 9.4 × 10.7 mm）中，加入 0.2 mL 培养基；或将 4 × 10⁴ 个 PC3 细胞接种至 35 mm 培养皿中，加入 1 mL 培养基。将细胞接种于由薄盖玻片（厚度：0.18 mm）构成的细胞培养兼容培养皿中。
      注意： 薄盖玻片可最大程度减少光的不利散射。
   2. 在最佳细胞培养条件下（37 °C，5% CO₂ 浓度，90% 湿度）孵育过夜，使细胞贴壁。
   3. 用外泌体耗竭培养基洗涤贴壁细胞两次（见步骤 1.1.1）。
2. 用荧光标记的细胞外囊泡（EVs）孵育细胞。
   1. 通过纳米颗粒追踪分析（NTA，图 3）测定荧光标记 EVs 的浓度（见步骤 1.3.5）。确定添加至培养细胞中的荧光标记 EVs 的最佳浓度（见步骤 2.1.2）。
   2. 用外泌体耗竭培养基稀释荧光标记的 EVs，使其达到步骤 2.2.1 中测定的目标浓度（例如，在 200 µL 外泌体耗竭培养基中加入 7.80 × 10⁹ 个 EVs（NTA 值））。
   3. 将稀释后的 EVs（步骤 2.2.2）加入步骤 2.1.2 中准备好的贴壁靶细胞中，孵育指定实验时间（例如 4、8 或 12 小时）。
   4. 用无外泌体培养基洗涤细胞三次，以去除未被内化的 EVs。
      注意： 可选：洗涤后可对细胞进行固定。
   5. 用 1 µg/mL 的 CMTMR（(5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲酰)氨基)四甲基罗丹明)（见材料表）对贴壁细胞的细胞质进行标记，并在最佳细胞培养条件下（37 °C，5% CO₂ 浓度，90% 湿度）孵育。
      注意： 细胞区域染料的荧光信号应与标记的 EVs 分离，以便在 EV 摄取实验中判断添加的 EVs 的空间位置（内化或表面附着）。
   6. 用外泌体耗竭培养基洗涤标记后的细胞两次，以去除残留染料。向细胞中加入新鲜的外泌体耗竭培养基，准备进行活细胞共聚焦成像。

3. 共聚焦显微镜

1. 进行活细胞成像时，使用载物台培养箱以维持最佳的细胞培养条件（37 °C，5% CO₂ 浓度，90% 湿度）。
2. 将准备好的细胞放入载物台培养箱中。
3. 根据对照样品设置成像参数。
   注意：建议的对照样品包括：仅带荧光标记的细胞外囊泡（EVs）、带荧光标记的细胞、未标记的细胞外囊泡以及未标记的细胞。
4. 确定目标细胞的深度以及Z方向上的层叠范围，以获取三维共聚焦图像。
   注意：Z层叠厚度为1 µm。共聚焦三维图像采集持续2分34秒（每个Z平面图像采集约需8秒，共采集二十个Z层叠图像）。
5. 同时设置针对细胞特异性染料（即红色）和细胞外囊泡特异性染料（即绿色）的多Z层叠图像采集（图4 和 图5A）。

4. 图像处理

1. 利用自动图像处理软件分析原始的z轴堆叠共聚焦图像，以确定细胞对EV的摄取情况（参见 材料表).
2. 设置阈值参数以对应细胞和EV特异性染料的荧光信号。构建细胞的虚拟表面（图5A、B).
   1. 要构建细胞的虚拟表面，请点击该按钮 添加新表面.
   2. 选择 最短距离计算 为“算法设置”以使用软件提供的算法，然后单击 下一步：源通道.
   3. 选择 通道 2 - CMTMR 本实验中称为“源通道”。
   4. 选择 平滑 并将适当的值输入“表面细节”以进行表面平滑处理。
      注意： 本实验中，1 像素代表原始成像数据中的 0.57 µm，因此为 0.57 µm。
   5. 选择 绝对强度 为“阈值分割”。
   6. 使用提供的算法自动对荧光图像进行阈值分割，请点击 阈值（绝对强度）：该值将自动设置.
   7. 选择 启用 为“分割接触的物体（区域生长）”，并将估计的细胞大小值填入“种子点直径”，本实验中为10.0 µm。然后单击 下一步：筛选种子点.
   8. 要配置虚拟细胞表面，请单击 + 添加 按钮，然后选择 质量 作为“滤波类型”。通过目视检查，将下限阈值设为适当值（本实验中为210），上限阈值设为最大值（1485），然后点击 完成 按钮。
      注意： 目视检查是指研究人员能够从原始荧光图像中区分出细胞区域。
   9. 接下来，为了构建囊泡的虚拟点，请点击按钮 添加新斑点.
   10. 选择 不同斑点尺寸（区域生长） 和 最短距离计算 为“算法设置”，然后单击 下一步：源通道.
   11. 选择 通道 1 - Alexa Fluor 488 本实验中称为“源通道”。
   12. 在“估计的XY直径”中输入适当的值，用于斑点检测。 1 µm 在此实验中。然后，单击 下一步：过滤斑点.
   13. 要配置虚拟 EV 点，请单击 + 添加 按钮，选择 质量 将“滤波类型”设为“Filter Type”，并通过目视检查设置“下限阈值”（Lower Threshold） 100 在此实验中。然后，单击 下一步：斑点区域类型 按钮
   14. 选择 绝对强度 为“斑点区域类型”，然后单击 下一步：标记区域.
   15. 通过目视检查，将“区域阈值”设置为适当数值，以对EV点状区域进行阈值分割， 100 本实验中称为“区域阈值”。
       注意： 目视检查意味着研究人员能够从原始荧光图像中区分出EVs区域。
   16. 选择 区域体积 为“直径来源”，然后单击 完成.
3. 使用软件提供的算法，在步骤 4.2 中将构建表面内聚集的斑点进行分离。图5C，i-iv).
   1. 点击已构建的 斑点，然后进入 滤光片.
   2. 点击 + 添加 按钮，然后选择 表面间最短距离 = 表面1 作为 滤器类型，然后点击 重复选择至新位点 按钮。低限的最低阈值（本实验中为 -7.0），以及上限的适当值（-0.5）。
      注意： 使用估计的半径设定上限 斑点在本实验中，估计的直径为 斑点即，EV dots，设定为 1 µm 在步骤 4.2.11 中；因此，上限可以是 0.5.
4. 细胞内EVs的自动计数
   注意： 软件将自动统计细胞内EV的数量，以指示靶细胞所内化的EV数目。
   1. 点击已构建的 斑点1的选择［表面间最短距离 = 表面1，范围介于 -7.00 至 -0.500 之间］。
   2. 前往 统计学，并从“Total Number of Spots”导出数值
      注意： 软件提供的算法将自动计算细胞的数量和体积。
5. 根据上述计算值确定每个孵育周期内EV摄取的产量（图6).
   1. 要获得细胞数量，点击内置的 表面 1，然后前往 统计学，并导出“总表面数量”的值 总体.
   2. 前往 详细 进入 统计学 导出 体积 从 详细.

结果

图1：基于纳米过滤微流控芯片的细胞外囊泡分离及芯片上标记的示意图。（A）从条件培养基（CCM）中分离细胞外囊泡。（B）细胞外囊泡的芯片上免疫荧光标记。（C）去除未结合的抗体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 抗人 CD63 抗体	Biolegend	353038	荧光染料偶联的细胞外囊泡特异性抗体
CellTracker Orange CMTMR 染料	Thermo Fisher Scientific	C2927	活细胞（细胞质）荧光标记试剂
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	共聚焦成像用物镜，NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	共聚焦成像用物镜，NA=0.75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	基于纳米过滤的微流控细胞外囊泡分离装置
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Exodisc 操作设备
去外泌体胎牛血清（Exosome-depleted FBS）	Thermo Fisher Scientific	A2720801	用于 PC3 细胞系来源细胞外囊泡收集的细胞培养基营养成分
胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）	VWR	1500-500	细胞培养用营养成分
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed	abcam	ab7063	用于细胞外囊泡标记阴性对照的小鼠 IgG 抗体
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	81156	共聚焦成像用培养皿
Imaris 9.7.1	Oxford Instruments	9.7.1	图像后期处理软件
Incubator System+ CO2/O2/N2 气体混合器	Live Cell Instrument	TU-O-20	用于活细胞成像的培养箱系统
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 相机	Nikon	NA	共聚焦成像用相机
Nikon Eclipse Ti 显微镜	Nikon	NA	共聚焦成像用倒置显微镜
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Nikon 显微镜图像处理软件
NTA，NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	细胞外囊泡浓度检测设备
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	绘图软件
青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin）	Thermo Fisher Scientific	15140122	细胞培养用抗生素
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	PC3 细胞系培养用细胞培养基
SYTO RNASelect Green Fluorescent 细胞染料 - 5 mM DMSO 溶液	Thermo Fisher Scientific	S32703	用于细胞外囊泡标记的 RNA 荧光染料