细胞外囊泡摄取实验：利用三维荧光成像技术可视化与定量细胞摄取细胞外囊泡的方法

摘要

来源：Kim, C. J., 等, 细胞外囊泡摄取实验 通过 共聚焦显微镜成像分析 视频实验杂志 (2022).

在本视频中，我们展示了一种用于可视化并定量细胞摄取细胞外囊泡（EVs）的实验方法。该方法利用共聚焦显微镜进行三维荧光成像，能够区分被细胞内化的EVs与黏附在细胞表面的EVs。

方案

1. 细胞外囊泡的分离及芯片内免疫荧光标记

1. 细胞培养基（CCM）的收集及用于细胞外囊泡（EV）分离的CCM预处理
   1. 将PC3细胞以30%汇合度接种于75 cm²细胞培养瓶中。在标准培养基及细胞系特异性补充物中培养对照细胞至约90%汇合度（约48小时）。
      注意：为防止含EV的组分影响细胞摄取（如胎牛血清），应使用无外泌体的培养基和补充物。
   2. 收集CCM。
   3. 在室温（RT）下以1000 × g离心10分钟，沉淀随培养基收集的未贴壁细胞和大块碎片。将上清液转移至新的锥形管中。
   4. 在新管中，于4 °C下以10,000 × g离心20分钟，以沉淀培养基中残留的小碎片和凋亡小体。部分较大的EV将同时沉淀。将上清液转移至新管中。
   5. 通过0.45 µm亲水性聚偏氟乙烯（PVDF）膜针头滤器过滤上清液。
      注意：若未立即进行EV分离，应将预处理后的CCM储存于-80 °C。若已冷冻，冻融循环次数应限制为一次。
2. 使用基于纳米过滤的微流控装置从CCM中分离EV
   1. 若已冷冻，需将CCM完全解冻，并在进行步骤1.2.2前涡旋振荡30秒。
   2. 将1 mL预处理后的CCM（步骤1.1）注入基于纳米....

结果

图1：基于纳米过滤微流控芯片的细胞外囊泡分离及芯片上标记的示意图。（A）从条件培养基（CCM）中分离细胞外囊泡。（B）细胞外囊泡的芯片上免疫荧光标记。（C）去除未结合的抗体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 抗人 CD63 抗体	Biolegend	353038	荧光染料偶联的细胞外囊泡特异性抗体
CellTracker Orange CMTMR 染料	Thermo Fisher Scientific	C2927	活细胞（细胞质）荧光标记试剂
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	共聚焦成像用物镜，NA=1.25
CFI Plan Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	共聚焦成像用物镜，NA=0.75
Exodisc	Labspinner Inc.	EX-D1001	基于纳米过滤的微流控细胞外囊泡分离装置
ExoDiscovery	Labspinner Inc.	EX-R1001	Exodisc 操作设备
去外泌体胎牛血清（Exosome-depleted FBS）	Thermo Fisher Scientific	A2720801	用于 PC3 细胞系来源细胞外囊泡收集的细胞培养基营养成分
胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS）	VWR	1500-500	细胞培养用营养成分
Goat Anti-Mouse IgG H&L preadsorbed	abcam	ab7063	用于细胞外囊泡标记阴性对照的小鼠 IgG 抗体
Ibidi USA U DISH μ-Dish 35 mm	Ibidi	81156	共聚焦成像用培养皿
Imaris 9.7.1	Oxford Instruments	9.7.1	图像后期处理软件
Incubator System+ CO2/O2/N2 气体混合器	Live Cell Instrument	TU-O-20	用于活细胞成像的培养箱系统
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 相机	Nikon	NA	共聚焦成像用相机
Nikon Eclipse Ti 显微镜	Nikon	NA	共聚焦成像用倒置显微镜
NIS-Elements AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Nikon 显微镜图像处理软件
NTA，NanoSight NS500	Malvern Panalytical	NS500	细胞外囊泡浓度检测设备
OriginPro 2020	OriginLab	9.7.0.185	绘图软件
青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin）	Thermo Fisher Scientific	15140122	细胞培养用抗生素
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21875034	PC3 细胞系培养用细胞培养基
SYTO RNASelect Green Fluorescent 细胞染料 - 5 mM DMSO 溶液	Thermo Fisher Scientific	S32703	用于细胞外囊泡标记的 RNA 荧光染料