病毒样颗粒捕获实验：利用中和抗体偶联磁珠从样本中分离展示抗原的病毒样颗粒的方法

摘要

来源：Rosengarten, J. F.，等。利用捕获法检测基于病毒样颗粒（VLP）疫苗中抗原的中和敏感性表位。J. Vis. Exp. (2022)。

在本视频中，我们演示了一种称为病毒样颗粒捕获实验的免疫沉淀检测方法，用于从样本中分离展示抗原的病毒样颗粒（VLP）。抗原与结合在磁珠上的特异性抗体结合，形成固定的抗原-抗体复合物，随后将其分离并保存，以用于进一步分析。

方案

1. 样品制备

1. 将来源于表达HIV结构基因gag（单独或与env共同表达）的293-F细胞的VLP生产悬浮细胞系，以0.5 × 10⁶ 个细胞/mL的低细胞密度接种于293-F表达培养基中。
2. 在37 °C、8% CO₂条件下，于振荡培养箱中以5 cm振幅、135转/分钟（rpm）的转速培养3–4天。
3. 以100 × g离心5分钟收集生产细胞。使用0.45 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜注射器滤器过滤上清液，以去除残留细胞和细胞碎片，获得无细胞的细胞培养上清液（CFSN）。
   注意：本步骤可暂停。CFSN可在4 °C保存过夜。
4. 可直接使用CFSN进行实验，或从35 mL CFSN中通过超速离心（112,700 × g，4 °C，1.5小时）沉淀VLP。
5. 超速离心后，弃去上清液，每根离心管中的VLP沉淀物重悬于200 µL 15%（w/v）海藻糖溶液中。
   注意：VLP沉淀物通常肉眼不可见。本步骤可暂停。VLP可在–80 °C保存。
6. 在进行VLP捕获实验前，使用ELISA测定含VLP样品中病毒核心蛋白的浓度。此步骤对于标准化捕获实验的加样量至关重要。

2. VLP 捕获实验

注意：工作流程的概述见图1。

1. 通过反复吹打或在50 rpm转速的旋转仪上混合至少5分钟，使磁珠充分重悬。
2. 同时，配制含有广谱中和抗体（bNAb）的抗体溶液。每个反应使用10 µg的每种bNAb，溶于200 µL抗体结合与洗涤缓冲液中（见材料表）。
   注意：抗体用量可能因所用bNAb的亲和力及病毒样颗粒（VLPs）表面抗原密度的不同而有所调整。
3. 每个反应使用50 µL磁珠溶液（见材料表），将磁珠转移至1.5 mL反应管中，并将反应管置于磁力分离架上。
   注意：也可使用强磁铁分别置于每根反应管一侧，以实现磁珠与上清液的分离。
4. 静置数分钟，待磁珠完全聚集于管壁，确保所有磁珠均被收集后，小心吸除上清液。
5. 移开磁铁，将步骤2.2中配制的200 µL bNAb溶液加入磁珠中，重悬磁珠。室温下于50 rpm转速旋转仪上孵育30分钟至3小时。
6. 再次将反应管置于磁力分离架上，静置后吸除上清液。
7. 从磁铁上取下反应管，加入200 µL抗体结合与洗涤缓冲液重悬磁珠，进行洗涤。
8. 重复步骤2.4，尽可能彻底去除洗涤缓冲液。
9. 将待测样品加入已结合bNAb的磁珠中。
   注意：使用HIV来源颗粒进行捕获实验时，每个反应的VLP输入量应至少为15 ng病毒核心蛋白。VLP用量可能因bNAb的亲和力及所用VLP表面抗原密度而异。
10. 若步骤2.9中加入的样品体积不足1 mL，需用PBS补足至1 mL。用移液器轻轻吹打使磁珠重悬。
11. 将样品与磁珠在室温下于旋转仪上孵育2.5小时，转速为50 rpm。孵育过程中应确保磁珠保持悬浮状态，溶液充分混匀。
12. 将反应管置于磁铁上，静置后吸除上清液。
13. 用200 µL洗涤缓冲液（见材料表）重悬磁珠进行洗涤，重复该洗涤步骤三次。
14. 用100 µL洗涤缓冲液重悬磁珠，并将悬液转移至洁净（耐热）的反应管中。
15. 将反应管置于磁力分离架上（见材料表），完全吸除上清液。
16. 按照步骤2.16.1–2.16.2制备变性SDS-PAGE样品，或按照步骤2.16.3–2.16.5从磁珠上洗脱VLPs以制备非变性样品。
    1. 制备变性SDS-PAGE样品时，将磁珠重悬于20–80 µL Laemmli缓冲液中（每1 ng p55 Gag检测输入量加入0.8 µL Laemmli缓冲液），于95 °C孵育5分钟。
    2. 可直接进行SDS-PAGE分析，或将样品于-20 °C保存。
       注意：Laemmli缓冲液含有2-巯基乙醇和十二烷基硫酸钠。操作时需佩戴防护手套和护目镜，避免接触皮肤、眼睛和衣物，切勿吸入蒸气。应在通风良好的环境中操作，例如通风橱内。
       注意：本步骤可暂停实验流程。
    3. 也可选择进行非变性洗脱，以获得保持天然蛋白结构的VLPs。
    4. 向磁珠中加入25 µL洗脱缓冲液（通常随磁珠试剂提供），室温孵育2–5分钟。
    5. 将磁珠分离后，收集上清液并转移至洁净反应管中。洗脱液可用于后续实验，或于4 °C保存。
       注意：本步骤可暂停实验流程。

结果

图1：利用无细胞上清液进行病毒样颗粒（VLP）捕获实验关键步骤的示意图。（1）VLP捕获实验首先将HIV-1广谱中和抗体（bNAbs）与蛋白G偶联的磁珠结合。同时，制备含有已知p55浓度的VLP溶液。无细胞培养上清液包含p55 Gag病毒样颗粒（VLPs）、宿主细胞蛋白和核酸的混合物。（2）将与bNAbs偶联的磁珠和VLP溶液转移至1.5 mL反应管中，并在旋转条件下孵育。（3）展示抗原的VLP被包被有bNAbs的磁珠捕获。随后在磁场中将这些免疫复合物与来源于宿主细胞的污染物分离。（4）通过移液去除上清液，并对磁珠进行三次洗涤以...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 反应管	Eppendorf
10x PBS	gibco	70011044
抗体（bnAbs）	Polymun Scientific
Dynabeads Protein G<br/> 免疫沉淀试剂盒	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	10007D	包含缓冲液和洗涤<br/> 溶液
FreeStyle 293-F 细胞	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	R790-07
FreeStyle 293 表达培养基	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
磁力分离架	New England Biolabs	S1509S	适用于 12 × 1.5 mL 或 6 × 1.5 mL 管
Optima XE-90 超速离心机	Beckman Coulter
聚偏二氟乙烯（PVDF）<br/> 注射器滤器，0.45 &micro;m	Carl Roth	KC89.1
PVDF 转印膜，0.45 &micro;m	Carl Roth	T830.1
QuickTiter HIV p24 ELISA 试剂盒	Cell Biolabs	VPK-108-H
旋转混合仪	Heidolph	REAX2
SW28 转子	Beckman Coulter
Thermomixer 恒温混匀仪	Cel Media	basic
海藻糖二水合物	Carl Roth	8897.2
Ultra Clear 离心管	Beckman Coulter	344058