基于三室阵列的阻抗测定:一种通过测量电阻抗来评估癌细胞侵袭潜力的实时分析技术

Abstract

来源:Sharif， GM et al.， 从共培养物中实时检测和捕获侵袭性细胞亚群。J. Vis. Exp. （2022 年）。

该视频描述了使用基于电阻抗的三腔室阵列的侵袭分析。该技术测量癌细胞在肿瘤微环境中常驻基质细胞分泌的可溶性因子影响下的侵袭潜力。

Protocol

1. 新的腔室设计（图 1）

1. 打开新的双室细胞分析仪板。将带有电极的顶部腔室放在一边。
2. 使用铣床，从细胞分析仪板的 U 形底孔中剃掉 2 mm。
3. 使用紫外线精选粘合剂将孔径为 0.2 μm 的 2 cm x 7 cm 聚醚砜 （PES） 膜连接到剃光孔的底部。留出 30 分钟的固化时间，以确保胶水完全固化且呈惰性。
4. 使用铣床沿侧面切出两个纵向狭缝 （1.5 mm x 5.6 mm），以卡入新制造的第三个腔室的脊中。
5. 使用铣床，创建第三个聚碳酸酯腔室，该腔室复制了细胞分析仪板的整体尺寸;72 毫米 x 18 毫米（材料表）。
6. 创建 4.8 mm 深、4.75 mm 直径的孔，以复制细胞分析仪板的 16 孔设计。这允许每孔 90 μL 的体积。
7. 在侧面，创建两个三角形脊，以便腔室锁定在步骤 1.4 中创建的原始狭缝中。三角形的水平部分为 1.5 毫米，垂直部分为 1.4 毫米，斜边为 2.052 毫米。
8. 在短边创建一个直径为 50.8 mm、高度为 1.397 mm 的旋钮，以适合原始板的缺口（图 1，中间）。
9. 每个孔使用 0.9 mm 厚的橡胶垫圈，以提供密封配合。

2. 细胞培养（MDA-MB-231、DCIS、DCIS-Δ4、J2-成纤维细胞）

1. 用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤贴壁细胞培养物（~70% 汇合）。
2. 加入 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液以将细胞提起。
3. 用含有血清的细胞培养基中和胰蛋白酶溶液，并使用等分试样的细胞悬液对细胞进行计数。
   注意:特定的细胞培养基可在表 1 中找到。

3. 患者来源的异种移植物解离

1. 使用无菌手术刀将新鲜的肿瘤块 （1 cm²） 切成细糊状。
2. 置于装有 20 mL DMEM F12 培养基的 50 mL 锥形管中，并补充有 3 mg/mL 胰蛋白酶和 2 mg/mL 胶原酶。
3. 在 37°C 的热摇床 （150 RPM） 中孵育 20 分钟。
4. 将试管以 500 x g 旋转 5 分钟;去除上清液。
5. 加入 20 μL DMEM F12 + 2% FBS 洗涤细胞;以 300 x g 离心 5 分钟并去除上清液。再重复洗涤两次。
6. 重悬于 1 mL PDX 培养基中（表 1）以计数细胞。

4. 骨髓细胞提取

1. 用 25 mL 的 1x PBS 冲洗骨髓 （BM） 收集过滤器。
   注意:在这项研究中，将 PBS 添加到医院用过的 BM 收集过滤器中，以收集过滤器中剩余的 BM。
2. 将冲洗后的 BM 缓慢加入到装有 25 mL 密度梯度介质的 50 mL 锥形管中，注意尽可能保持各层分开。
3. 在 18 °C 下以 800 x g 旋转 20 分钟。
4. 离心后虹吸顶层（脂肪/血浆），并将含有 BM 细胞的密度梯度培养基上方的 5 mL 白色层转移到 15 mL 锥形管中><。 注意:或者，将 5 mL 移液器浸入顶层，直到它接触到中间层 （BM），然后在不移动移液器的情况下非常缓慢地移出中间层。
5. 用 1x PBS （~10 mL） 填充 15 mL 锥形管，并以 300 x g 离心 15 分钟。
6. 去除上清液;剩余的白色沉淀是 BM。
7. 如果在沉淀中观察到红细胞，则加入 5 mL RBC 裂解液（材料表），并在室温 （RT） 下静置 5 分钟。以 300 x g 旋转 5 分钟，然后去除上清液。
8. 加入 10 mL 的 1x PBS 洗涤细胞，以 300 x g 旋转 5 分钟，然后去除上清液。重复 RBC 裂解（步骤 4.7），直到沉淀呈白色。

5. 细胞接种和组装

1. 将所有三个无菌室放入组织培养罩中。
2. 找到下腔室短边的旋钮。调整下腔室的方向，使旋钮面向实验者。
3. 将 30,000-50,000 个细胞添加到 90 μL 培养基中，添加到下腔室的每个孔中。避免形成气泡。这些是基质细胞，将提供分泌因子，但不会被顶室的电极检测到。
4. 在两个下腔室孔中使用 5% 胎牛血清补充培养基作为细胞运动的阳性对照。使用补充 0% 血清的培养基作为阴性对照。
5. 让带有细胞的下腔室在罩中静置 10-15 分钟><。 注意:如果细胞贴壁或在悬浮液中生长，则建议执行此步骤。
6. 将下腔室旋转 90°，并将中腔室放在顶部，使下腔室的旋钮滑入中腔室的槽口中。
   注意:下腔室上的旋钮和中腔室上的蓝点位于组件的两端。
7. 垂直向下推，直到从组件的每个长边听到咔嗒声。
8. 将 160 μL 无血清培养基添加到中腔室的所有孔中。
9. 确保在孔填充后可以看到圆顶形弯液面;否则，请根据移液器校准调整最终体积。避免形成气泡。
10. 将电极朝下的顶部腔室放在中腔室上，确保将中间腔室和顶部腔室上的蓝点对齐。
11. 垂直向下推，直到从组件的每个长边听到咔嗒声。
12. 将 25-50 μL 无血清培养基添加到顶部腔室中。
13. 将组件安装在组织培养箱中的两用细胞分析仪上，等待 30 分钟后再测量背景><。 注意:这个时间对于平衡阵列是必要的，可用于准备要添加到顶部腔室的细胞系。
14. 测量背景（参见第 6 节）并将组件放回组织培养罩中。
15. 将 30,000-50,000 个细胞添加到 100 μL 无血清培养基中，添加到顶部腔室的每个孔中。这些是电极成功迁移穿过膜后将检测到的细胞
    注意:为了获得最大响应，建议在进行检测前在无血清或低血清培养基中培养细胞 6-18 小时。
16. 让组件在罩中静置 30 分钟，然后安装到两用细胞分析仪上进行阻抗测量。

6. 背景和阻抗测量

1. 将阵列放入两用细胞分析仪仪器的支架中。
2. 打开细胞分析仪软件并选择要使用的抽架。
3. 单击"消息"选项卡并确保其显示"连接确定"，以确保阵列正确放置在支架中，并且电极与传感器对齐。
4. 单击 Experiment Notes 选项卡，并尽可能多地填写有关实验的信息。
5. 单击 Layout 选项卡并填写数组布局的描述。
6. 单击"计划"选项卡，然后从"步骤"菜单中添加两个步骤;一个背景步骤（一次扫描）和一个具有 100 次扫描的测试步骤 - 每 15 分钟扫描一次，总共 25 小时。
7. 阵列在两用细胞分析仪培养箱中放置 30 分钟后，单击"播放"按钮开始背景测量。将弹出一个窗口，要求选择要保存数据的文件夹。
8. 背景测量完成后，从支架中取出阵列并将其放回细胞培养罩中。
9. 如步骤 5.13 所述，将细胞添加到顶部腔室中，并将组件在组织培养罩中放置 30 分钟，使细胞沉淀。
10. 将阵列放回两用单元分析仪中，然后检查 Connections OK 消息的 Message 选项卡。
11. 单击 Play 按钮开始阻抗测量。
12. 单击 Plot 选项卡以监控信号的进度。
13. 如果在 25 小时之前到达终点，请单击 Abort 下拉菜单中的 Execute 步骤。
14. 要导出数据，请右键单击图表，选择列表格式的 Copy，然后将数据粘贴到电子表格中><。 注意:数据可以导出为 cell index 或 delta cell index。还可以选择图形和/或布局信息进行导出。

表 1:细胞培养基组成。 下表列出了 MDA-MD-231 培养基、J2 成纤维细胞培养基、DCIS 培养基和 PDX 培养基的成分。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 媒体 成分 浓度/比例 MDA-MD-231 媒体 DMEM 系列 胎牛血清 （FBS） 10% J2 成纤维细胞培养基 DMEM 系列 胎牛血清 （FBS） 10% DCIS 媒体 DMEM F12 系列 马血清 （HS） 5% 表皮生长因子 （EGF） 20 纳克/毫升 胰岛素 10 微克/毫升 氢化可的松 0.5 微克/毫升 霍乱毒素 100 纳克/毫升 PDX 媒体 DMEM F12 系列 胎牛血清 （FBS） 2% HEPES 系列 1 米 胰岛素转铁蛋白硒乙醇胺 （ITS） 10 微克/毫升 氢化可的松 0.5 微克/毫升 牛血清白蛋白 （BSA） 1 毫克/毫升

Results

图 1:阵列室和修改的图像。

（A） 用于构建数组的三个腔室。没有对包含电极的顶部腔室进行修改。（B） 从中间腔室孔中，已剃掉 2 mm 的高度，并将膜连接到开口底部;在每侧增加纵向狭缝 （1.5 mm x 5.6 mm）。（C） 为复制 16 孔设计而制造的下腔室 （72 mm x 18 mm）;孔深 4.8 mm，直径 4.75 mm，沿侧面添加三角形脊（水平 1.5 mm x 垂直 1.4 mm），以卡入中腔狭缝。

Materials