基于三室阵列的阻抗检测法：通过测量电学阻抗实时分析癌细胞侵袭潜能的技术

摘要

来源：Sharif, G. M. 等，共培养物中侵袭性细胞亚群的实时检测与捕获。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频介绍了一种基于电阻抗的三室阵列侵袭实验。该技术用于测量在肿瘤微环境中常驻基质细胞所分泌的可溶性因子影响下，癌细胞的侵袭潜能。

方案

1. 新型腔室设计（图1）

1. 打开一个新的双室细胞分析仪板，将带有电极的上室放置一旁备用。
2. 使用铣床将细胞分析仪板U形底部孔的底部削去2 mm。
3. 使用紫外光固化胶将一片尺寸为2 cm × 7 cm、孔径为0.2 μm的聚醚砜（PES）膜粘附在削平的孔底部。静置30分钟，确保胶水完全固化且呈惰性。
4. 使用铣床沿两侧切出两个纵向狭缝（1.5 mm × 5.6 mm），以便与新制作的第三室的凸缘卡合。
5. 使用铣床制作一个第三个多碳酸酯室，其整体尺寸与细胞分析仪板相同，为72 mm × 18 mm（材料表）。
6. 制作深度为4.8 mm、直径为4.75 mm的孔，以复制细胞分析仪板的16孔设计，每孔可容纳90 μL体积。
7. 在侧面制作两个三角形凸缘，使该室能够卡入在步骤1.4中创建的原始狭缝中。三角形的水平边为1.5 mm，垂直边为1.4 mm，斜边为2.052 mm。
8. 在短边处制作一个直径为50.8 mm、高度为1.397 mm的旋钮，以嵌入原始板的凹槽中（图1，中图）。
9. 每个孔使用一个厚度为0.9 mm的橡胶垫圈，以实现密封配合。

2. 细胞培养（MDA-MB-231、DCIS、DCIS-Δ4、J2-成纤维细胞）

1. 用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞培养物（约 70% 汇合度）。
2. 加入 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，使细胞脱落。
3. 用含血清的细胞培养基中和胰蛋白酶溶液，并取部分细胞悬液计数细胞。
   注意： 具体的细胞培养基信息见 表 1。

3. 患者来源异种移植瘤的解离

1. 使用无菌手术刀将一块新鲜的肿瘤组织（1 cm²）切碎成细小的组织糜状物。
2. 将组织放入一个50 mL锥形管中，加入20 mL DMEM F12培养基，其中添加3 mg/mL胰蛋白酶和2 mg/mL胶原酶。
3. 在37°C条件下，以150 RPM的转速在恒温振荡器中孵育20分钟。
4. 以500 × g 离心5分钟，弃去上清液。
5. 加入20 μL DMEM F12 + 2% FBS洗涤细胞，以300 × g 离心5分钟，弃去上清液。重复洗涤两次。
6. 用1 mL PDX培养基（表1）重悬细胞，进行细胞计数。

4. 骨髓细胞提取

1. 用 25 mL 的 1× PBS 冲洗骨髓（BM）收集滤器。
   注意： 本研究中，向医院使用过的骨髓收集滤器中加入 PBS，以收集滤器中残留的骨髓。
2. 将冲洗所得的骨髓缓慢加入含有 25 mL 密度梯度介质的 50 mL 锥形管中，注意尽量保持两层液体分离。
3. 在 18 °C 下以 800 × g 离心 20 分钟。
4. 离心后吸除上层液体（脂肪/血浆），并将密度梯度介质上方含有骨髓细胞的白色层转移 5 mL 至 15 mL 锥形管中。
   注意： 也可将 5 mL 移液器插入上层液体，直至接触中间层（骨髓），然后缓慢吸取中间层，过程中不移动移液器。
5. 用 1× PBS 加满 15 mL 锥形管（约 10 mL），以 300 × g 离心 15 分钟。
6. 弃去上清液，剩余的白色沉淀即为骨髓细胞。
7. 若在沉淀中观察到红细胞，加入 5 mL 红细胞裂解液（材料表），室温（RT）静置 5 分钟。以 300 × g 离心 5 分钟后弃去上清液。
8. 加入 10 mL 1× PBS 洗涤细胞，以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复红细胞裂解步骤（步骤 4.7），直至沉淀呈白色。

5. 细胞接种与组装

1. 将三个无菌腔室均放入组织培养超净台中。
2. 找到下层腔室短边上的旋钮。调整下层腔室方向，使旋钮朝向实验操作者。
3. 在下层腔室每个孔中加入90 μL培养基，接种30,000–50,000个细胞。避免产生气泡。这些是基质细胞，可分泌因子，但不会被上层腔室的电极检测到。
4. 在两个下层腔室孔中使用含5%胎牛血清的培养基作为细胞迁移的阳性对照；使用无血清培养基作为阴性对照。
5. 将含有细胞的下层腔室在超净台中静置10–15分钟，使细胞沉降。
   注意：若细胞为贴壁细胞或悬浮生长细胞，建议执行此步骤。
6. 将下层腔室旋转90°，并将中层腔室置于其上，使下层腔室的旋钮插入中层腔室的凹槽中。
   注意：下层腔室的旋钮与中层腔室的蓝色标记点位于组件的相对两端。
7. 垂直向下按压，直至组件两侧长边均发出“咔”声。
8. 向中层腔室所有孔中加入160 μL无血清培养基。
9. 加样后应可见穹顶状弯月面；若不可见，需根据移液器校准调整最终体积。避免产生气泡。
10. 将上层腔室电极朝下放置于中层腔室上，确保中层与上层腔室的蓝色标记点对齐。
11. 垂直向下按压，直至组件两侧长边均发出“咔”声。
12. 向上层腔室中加入25–50 μL无血清培养基。
13. 将组件安装至组织培养孵育箱内的多功能细胞分析仪上，等待30分钟后再测量背景值。
    注意：此等待时间用于使阵列达到平衡，同时可用于准备将要加入上层腔室的细胞系。
14. 测量背景值（参见第6节），然后将组件放回组织培养超净台中。
15. 在上层腔室每个孔中加入100 μL无血清培养基，接种30,000–50,000个细胞。这些细胞在成功穿过膜后将被电极检测到。
    注意：为获得最大响应，建议在进行检测前将细胞在无血清或低血清培养基中培养6–18小时。
16. 将组件在超净台中静置30分钟，然后安装至多功能细胞分析仪进行阻抗测量。

6. 背景与阻抗测量

1. 将阵列放入多功能细胞分析仪的支架中。
2. 打开细胞分析软件，并选择要使用的支架。
3. 点击 消息 标签，确认显示 连接正常 ，以确保阵列已正确放置在支架中，且电极与传感器对齐良好。
4. 点击 实验记录 标签，并尽可能填写有关实验的详细信息。
5. 点击 布局 标签，并填写阵列布局的描述。
6. 点击 时间表 标签，从 步骤 菜单中添加两个步骤：一个背景测量步骤（单次扫描）和一个测试步骤（共100次扫描，每15分钟一次，总计25小时）。
7. 阵列在多功能细胞分析仪培养箱中放置30分钟后，点击 运行 按钮以开始背景测量。此时将弹出窗口，提示选择保存数据的文件夹。
8. 背景测量完成后，将阵列从支架中取出，并放回细胞培养超净台中。
9. 按照 步骤 5.13 所述，向顶部腔室中加入细胞，并将组件保留在组织培养超净台中30分钟，使细胞沉降。
10. 将阵列重新放入多功能细胞分析仪中，并检查 消息 标签是否显示 连接正常。
11. 点击 运行 按钮以开始阻抗测量。
12. 点击 绘图 标签以监控信号进展。
13. 如果在25小时之前达到实验终点，请从 执行 下拉菜单中点击 中止 步骤。
14. 如需导出数据，可右键点击图表，从列表格式中选择 复制 ，然后将数据粘贴至电子表格中。
    注意： 数据可导出为细胞指数或Δ细胞指数。也可选择导出图表和/或布局信息。

表1：细胞培养基成分。 该表格列出了MDA-MB-231培养基、J2成纤维细胞培养基、DCIS培养基和PDX培养基的成分。

培养基	成分	浓度/比例
MDA-MD-231 培养基	DMEM
	胎牛血清 (FBS)	10%
J2 成纤维细胞培养基	DMEM
	胎牛血清 (FBS)	10%
DCIS 培养基	DMEM F12
	马血清 (HS)	5%
	表皮生长因子 (EGF)	20 ng/mL
	胰岛素	10 μg/mL
	氢化可的松	0.5 μg/mL
	霍乱毒素	100 ng/mL
PDX 培养基	DMEM F12
	胎牛血清 (FBS)	2%
	HEPES	1 M
	胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺 (ITS)	10 μg/mL
	氢化可的松	0.5 μg/mL
	牛血清白蛋白 (BSA)	1 mg/mL

结果

图1：阵列腔室及其改进结构的图像。

（A）用于构建阵列的三个腔室。顶部腔室容纳电极，未作任何修改。（B）中间腔室的孔已削去2 mm高度，并在敞口底部连接一层膜；在每侧增加了纵向狭缝（1.5 mm × 5.6 mm）。（C）下部腔室（72 mm × 18 mm）按16孔设计制造；孔深4.8 mm，直径4.75 mm，在侧壁添加了三角形凸脊（水平方向1.5 mm × 垂直方向1.4 mm），用于与中间腔室的狭缝卡合。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Thermofisher	25300-054
粘合剂	Norland Optical Adhesive	 NOA63
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A9418
细胞刮刀	Sarstedt	83.1832
霍乱弧菌来源的霍乱毒素	Thermofisher	 12585-014
CIM-板	Agilent 5665817001		细胞分析板
产气荚膜梭菌来源的胶原酶	Sigma	C0130
DMEM	Thermofisher	 11995-065
DMEM-F12	Thermofisher	11875-093
胎牛血清（FBS），热灭活	Omega Scientific	 FB-12
HEPES	 Thermofisher	15630106
马血清（HS）	Gibco	16050-122
人表皮生长因子（EGF）	Peprotech	AF-100-15
氢化可的松	 Sigma	 H4001
胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITSX）（100倍浓缩液）	Thermofisher	51500056
人重组胰岛素锌溶液	Sigma	C8052
J2 成纤维细胞	Stemcell (RRID:CVCL_W667)	 100-0353
LymphoPrep	Stemcell	7851	用于单个核细胞分离的密度梯度介质
Matrigel	Corning	354230	基底膜基质
MCFDCIS.com 细胞（DCIS）	RRID:CVCL_5552
MDA-MB-231 细胞	 RRID:CVCL_0062
铣床			 Bridgeport Series 1 Vertical
磷酸盐缓冲液（1倍浓度）	Thermofisher	10010049
聚醚砜（PES）膜	Sterlitech	PCTF029030
红细胞裂解液	Stemcell	7800
RTCA DP 分析仪	Agilent	3X16	 双用途细胞分析仪
胰蛋白酶	Sigma	 T4799