柠檬酸合酶活性检测：一种比色法测定果蝇组织匀浆中线粒体柠檬酸合酶活性的实验方法

摘要

来源：Wei, P., 等., 柠檬酸合酶活性的比色法测定 黑腹果蝇. 视频实验杂志 (2020)

本视频介绍了一种比色法检测，用于测定黑腹果蝇（Drosophila）组织匀浆中线粒体柠檬酸合酶的活性。

方案

1. 黑腹果蝇（D. melanogaster）柠檬酸合酶活性比色法检测

1. 每个样本收集十只成年果蝇。每种基因型至少收集三个重复样本。
2. 为每个样本在1.5 mL离心管中准备500 µL冰预冷的提取缓冲液，其中包含20 mM HEPES（pH = 7.2）、1 mM EDTA和0.1% Triton X-100。
3. 在麻醉垫上用CO₂麻醉成年果蝇，并分离所需组织。例如，若要分离成年果蝇的胸部，可用镊子固定果蝇胸部，然后用剪刀沿胸部与腹部交界处剪下，分离出果蝇腹部。收集果蝇胸部用于肌肉柠檬酸合酶活性测定。
   注意：若需用组织鲜重来标准化柠檬酸合酶活性，应在该步骤测定组织鲜重。
4. 立即将10只成年果蝇的胸部转移至100 µL冰预冷的提取缓冲液中，并在冰上用研磨杵充分匀浆。为保持样品处于冰冻状态，每次在冰上匀浆5–10秒后，将样品置于冰上静置5秒，重复操作直至管内所有组织完全匀浆。
   注意：可用胶带固定离心管，检查匀浆液中无凝块存在，确保管内组织已完全匀浆。所有样品处理步骤均应在冰上进行。
5. 取每份匀浆样品10 µL转移至新的离心管中，用于蛋白质含量测定。将用于蛋白测定的样品保持在冰上。
   注意：蛋白样品可冷冻并储存在-80 °C以备后续分析。蛋白浓度将作为柠檬酸合酶活性标准化的内参参数。
6. 向每个剩余样品中加入400 µL冰预冷的提取缓冲液，使总体积达到500 µL。通过轻柔吹打至少5次充分混匀，避免产生气泡。对于每个反应，向150 µL新鲜配制的反应溶液（20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.1 mM DTNB、0.3 mM乙酰辅酶A、1 mM草酰乙酸）中加入1 µL稀释后的细胞裂解液。轻轻吹打充分混匀并立即开始反应，避免产生气泡。使用可检测412 nm吸光度的酶标仪，在25 °C下每隔10–30秒测定一次412 nm处的吸光度，持续4分钟，最小间隔为10秒。
   注意：吸取不同试剂前应更换吸头，避免在孔中产生气泡。试剂混合不充分可能导致测量结果出现偏差。柠檬酸合酶活性测定应在样品收集后立即于室温下进行，因为该测定用于定量完整线粒体的数量。反应缓冲液应在使用前现配，不得储存。
7. 以光密度（OD）吸光度（abs）为纵坐标（Y轴），时间为横坐标（X轴，单位为分钟）作图。然后计算曲线线性部分的斜率，此时反应速率为
   
   将该值除以样品的蛋白浓度，以标准化柠檬酸合酶活性。柠檬酸合酶活性按以下公式计算：
   
   注意：样品蛋白浓度可通过蛋白浓度检测试剂盒进行测定。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸 (HEPES) 	Sigma-Aldrich	 V900477
2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇 (TRIZMA Base)	Sigma-Aldrich	V900483
乙酰辅酶A (Acetyl-CoA)	Sigma-Aldrich	A2181
二硫代双硝基苯甲酸 (DTNB)	Sigma-Aldrich	D8130
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Sigma-Aldrich	V900106
草酰乙酸 (Oxaloacetate)	Sigma-Aldrich	O4126
研磨杵 (Pellet pestle)	Sangon	F619072
研磨杵电机 (Pellet pestle motor)	Tiangen	OSE-Y10
酶标仪 (Plate reader)	BioTek	Eon
蛋白质BCA检测试剂盒 (Protein BCA Assay kit)	Beyotime	P0010S
剪刀 (Scissors)	WPI	14124
吐温X-100 (Triton X-100)	Sangon	A110694-0100