基于溶葡萄球菌酶的酶保护实验：一种体外定量细胞内细菌的方法 金黄色葡萄球菌 通过酶介导的选择性杀灭细胞外细菌进行负载

摘要

来源：Rigaill, J. 等. 改进的酶保护实验用于研究 金黄色葡萄球菌 抗菌化合物的内化及其胞内功效 J. Vis. Exp. (2021).

在本视频中，我们展示了一种基于溶葡萄球菌酶的 体外 酶保护测定法用于定量 金黄色葡萄球菌 在A549细胞中的内化作用。该检测有助于对宿主细胞内细菌载量进行定性、定量及表征研究。

方案

1. 细胞接种

1. 使用含酚红的高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），并添加 10% 胎牛血清（FBS）但不含抗生素，培养 A549 人上皮细胞。
2. 用低倍显微镜观察 24 孔板的每一孔，确保人上皮细胞状态良好且生长正常。
3. 移除并丢弃 24 孔板中的用过的细胞培养液。
4. 向长满 100% 汇合度细胞的各孔中，每孔加入 500 µL 用不含酚红的 DMEM 制备的 Staphylococcus aureus 菌液，进行接种。
5. 将细胞在 36 ± 1 °C 及 5% CO₂ 条件下孵育 2 小时。
   注意：建议每个实验条件使用 3 孔（设为三复孔），并至少进行 3 次独立实验。孵育时间可根据实验目的适当调整。

2. 采用改进的酶保护法（iEPA）定量细胞内细菌

1. 用3.5 mL无菌水中的2% Triton X-100与3.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液混合，配制7 mL 4倍裂解缓冲液。
2. 用乙酸盐缓冲液配制10 mg/mL的溶葡球菌素原液，并将25 µL分装至冻存管中。可在-80 °C保存长达6个月。
3. 取25 µL溶葡球菌素原液（10 mg/mL）与225 µL 0.1 M Tris-HCl混合，新鲜配制250 µL浓度为1 mg/mL的溶葡球菌素工作液。可在4 °C保存最多48小时。
4. 将250 µL溶葡球菌素工作液加入6 mL完全感染培养基中，配制6.25 mL含溶葡球菌素的完全感染培养基。
5. 向每孔中加入250 µL含溶葡球菌素的完全感染培养基，并用手轻轻旋转培养板，使液体均匀混匀。
6. 将细胞在36 ± 1 °C、5% CO₂ 条件下孵育1小时，使溶葡球菌素杀灭胞外细菌。
7. 孵育结束后，向每孔中加入10 µL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K，以灭活溶葡球菌素。
8. 在室温下孵育2分钟。
9. 加入250 µL 4倍裂解缓冲液，通过渗透压休克裂解细胞。
10. 在36 ± 1 °C孵育10分钟。
11. 用移液器在孔底反复吹打10次，充分混匀，确保细胞完全裂解并均质化。
12. 使用自动螺旋涂布仪测定每孔中 S. aureus 的载量。
13. 将琼脂平板在36 ± 1 °C孵育18–24小时。
14. 次日，使用菌落计数器计数菌落数量，计算每孔的胞内 S. aureus 载量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	CORNING-FALCON	353047
A549细胞系	ATCC	CCL-185
乙酸盐缓冲液 pH 4.6	Fluka	31048	用于在20 mM醋酸钠溶液中配制10 mg/mL的溶葡球菌素储备液。
AMBICIN（重组溶葡萄球菌素）	AMBI	LSPN-50	冻干重组溶葡萄球菌素。于 -80 ℃ 冻存 °长期储存温度为 C。
COS - 哥伦比亚琼脂 + 5% 羊血	生物梅里埃	43049	可使用任何适合培养葡萄球菌的琼脂平板替代。
含酚红高糖改良伊格尔培养基	Sigma-Aldrich	D6429
高糖酚红-free DMEM培养基	Sigma-Aldrich	D1145
杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	D8537
杜尔贝科′含MgCl₂的磷酸盐缓冲液 和 CaCl2，经无菌过滤	Sigma-Aldrich	D8662
杜尔贝科′磷酸盐缓冲液，经无菌过滤	Sigma-Aldrich	D8537
Easyspiral 稀释液	Interscience	414000	自动稀释仪和螺旋接种仪
胎牛血清	Gibco	10270-106
蛋白酶K，重组，20 mg/mL	Eurobio	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg，批号 901727
Scan 4000	国际科学	438000	自动菌落计数器
无菌水	OTEC	600500
TC20全自动细胞计数仪	伯乐（Bio-Rad）	1450102	自动细胞计数器
Tris 1 M pH 8.0	Invitrogen	AM9855G	用于在 0.1 M Tris-HCl 中配制 1 mg/mL 的溶葡球菌酶工作液。
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T3924	Hanks 液中的 0.05% 胰蛋白酶（猪源）和 0.02% EDTA′ 含酚红平衡盐溶液
宽场荧光显微镜	Nikon	Ti2