基于浴酚蒽啉磺酸盐的比色法检测：一种简单快速测定小鼠肝组织中非血红素铁含量的方法

摘要

来源：Duarte, T. L., Neves, J. V. 基于邻菲罗啉比色法测定组织非血红素铁含量。J. Vis. Exp. (2022)

在本视频中，我们介绍一种基于比色法测定小鼠肝组织中非血红素铁含量的方法。在还原剂存在下，以邻菲啰啉磺酸钠作为显色底物，可将三价铁还原为可螯合的二价铁。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核

1. 溶液配制

注意：所有试剂和溶液的处理与配制均需使用无铁玻璃器皿或一次性塑料器皿。严禁金属实验材料（例如不锈钢刮勺）接触任何试剂或溶液，以免造成铁污染。确保所有可重复使用的玻璃器皿均为无铁材质。使用适当的实验室洗涤剂清洗器皿30-60分钟，用去离子水冲洗，再用去离子水按1:3比例稀释的37%硝酸溶液浸泡过夜，再次用去离子水冲洗，然后晾干。

1. 酸混合液：在玻璃瓶中加入10 g三氯乙酸至82.2 mL 37%盐酸中，充分溶解后用去离子水定容至100 mL。使用前摇匀。或者，仅使用37%盐酸进行组织消化。
   注意：该溶液在避光的棕色玻璃试剂瓶中保存时，至少可稳定2个月。
   警告：盐酸和三氯乙酸具有腐蚀性，其浓溶液会释放有毒酸性蒸气。操作酸类时必须始终穿戴防护服、耐化学腐蚀手套和防化学飞溅护目镜。避免吸入蒸气，并始终在通风橱内操作酸类。
2. 饱和醋酸钠溶液：在玻璃瓶中将228 g无水醋酸钠加入400 mL去离子水中，室温下振荡过夜。静置沉淀1天。若无沉淀析出，继续少量添加醋酸钠直至饱和。将溶液储存于玻璃瓶中。
3. 显色剂试剂：配制1 mL显色剂试剂时，将1 mg 4,7-二苯基-1,10-菲啰啉二磺酸二钠盐溶于500 µL去离子水中，加入10 µL浓（100%）巯基乙酸，充分溶解后用去离子水定容至1 mL。
   注意：按需配制显色剂试剂。避光保存时，该溶液可稳定保存1个月。
4. 工作用显色剂（WCR）：取1份体积的显色剂试剂，加入5份体积的饱和醋酸钠溶液和5份体积的去离子水，混匀。
   注意：该溶液应在使用当天新鲜配制。
5. 铁标准储备液：配制20 mM铁储备液时，将111.5 mg羰基铁粉置于含有5,480 µL 37%盐酸的250 mL容量瓶中。室温下静置溶解过夜（或置于沸水浴中孵育）。然后用去离子水定容至100 mL。
   注意：该标准溶液在密封良好的容器中可长期保存。
6. 工作用铁标准溶液（WISS）：在500 µL去离子水中加入13.5 µL 37%盐酸，再加入10 µL铁标准储备液，最后用去离子水定容至1 mL（含铁11.169 µg/mL，200 µM；经原子吸收光谱法测定）。
   注意：该工作溶液应在使用当天新鲜配制。

2. 样品干燥

1. 用手术刀切取一块重10-100 mg的组织样品，将其置于称量纸上，使用分析/精密天平准确称重（鲜重）。
2. 使用塑料镊子将组织样品放入24孔板中（不加盖，以允许水分蒸发），并在65 °C的普通培养箱中干燥48小时。
3. 或者，可使用实验室微波消解炉干燥组织样品。使用塑料镊子将已称重的组织样品放入无铁的聚四氟乙烯（Teflon）杯中，并在微波炉中进行干燥。操作参数应根据仪器使用说明书进行设置。
   注意： 作为参考，使用特定消解炉（见材料表）干燥肝脏样品的操作参数见表1。
4. 使用塑料镊子将每份干燥后的组织样品置于称量纸上，放入分析/精密天平中，准确称重（干重）。

3. 样品酸性消化

1. 使用塑料镊子将每块干燥的组织转移至1.5 mL微量离心管中。
2. 加入1 mL酸混合液并盖紧微量离心管。同时制备酸空白对照，除不加组织外，其余操作相同。
   注意： 酸混合液具有腐蚀性，并会释放有毒蒸气。操作时应穿戴防护服、耐化学腐蚀手套和防化溅护目镜。避免吸入其蒸气，且务必在通风橱内操作。
3. 将微量离心管置于65 °C培养箱中孵育20小时，以消化组织。
4. 冷却至室温后，使用配有塑料吸头的移液器吸取500 µL澄清（黄色）酸提取液（上清液）至新的1.5 mL微量离心管中。若无法获得澄清上清液，可进行短暂离心。
   注意： 上清液酸性极强。操作时应穿戴防护服、耐化学腐蚀手套和防化溅护目镜，并始终在通风橱内进行。
   备注： 此时酸提取液可立即用于比色测定，或于-20 °C冷冻保存以备后续使用。使用前需将冷冻样品完全解冻至室温，并涡旋混匀。

4. 显色反应

1. 根据表2中的指示，在1.5 mL微量离心管中配制显色反应液；若需高通量操作，可直接在平底、96孔、透明、未处理的聚苯乙烯微孔板中进行。所有反应（酸空白、标准品和样品）均需至少设置两个重复。
2. 室温孵育15分钟。

5. 吸光度读数

1. 使用去离子水作为空白对照，在分光光度计或酶标仪中于535 nm波长处测定样品的吸光度。酶标板可在加盖或不加盖条件下读数。若选择加盖读数，需在测量前去除因酸蒸气释放而在盖子内表面形成的冷凝液，以避免对吸光度读数造成干扰。
   注意： 酸空白以去离子水（参比）为对照测得的光吸收值应小于0.015；标准品和样品的光吸收值应在0.100至1.000之间。对于铁含量极高或极低的样品，可调整酸提取液（上清液）和去离子水的取样体积₂O 可能需要调整 （表 2）：如果吸光度大于1.0，则使用较小的样品（上清液）体积；如果吸光度低于0.1，则使用较大的上清液体积。计算每个样品的组织铁含量时需考虑样品体积（Vsmp）（见步骤6）。

6. 组织铁含量的计算

1. 使用以下公式计算非血红素组织铁含量：
   
   组织铁含量（µg/g 干组织）= 公式 1
   AT = 测试样品的吸光度
   AB = 酸空白的吸光度
   AS = 标准品的吸光度
   Fes = WISS 铁标准液中铁浓度（µg Fe/mL）
   W = 干组织重量（g）
   Vsmp = 样品体积（表 2 中上清液的可变体积，换算为 mL）
   Vf = 65 °C 过夜孵育后酸混合物的最终体积（对应于酸体积加上干组织体积，单位为 mL；若样品重量无显著差异，可假设为恒定体积 ≈ 1 mL）
   Vstd = 铁标准液体积（表 2 中 WISS 的体积，换算为 mL）
   Vrv = 反应终体积（表 2 中总体积，换算为 mL）

表1：此处使用的微波消解炉中肝脏干燥的操作参数

功率 650W (%)：	10	15	20	25	30
压力 (PSI)：	0	0	0	0	0
时间 (min)：	10	15	30	30	40
加压时间 (TAP)：	0	0	0	0	0
风扇 (FAN)：	50	50	50	50	50

表2：在1.5 mL离心管或96孔板中进行显色反应的配制。

		WCR (µL)	酸混合液 (µL)	上清液 (µL)	WISS (µL)	diH2O (µL)	总体积 (µL)
1.5 mL 离心管	酸空白	1000	150			150	1300
	标准品	1000	150		150		1300
	样品	1000		可变		可变	1300
96 孔微孔板	酸空白	150	22.5			22.5	195
	标准品	150	22.5		22.5		195
	样品	150		可变		可变	195

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96 孔紫外透明板	Sarstedt	82.1581.001
分析天平	Kern	ABJ 220-4M
无水乙酸钠	Merck	106268
邻菲罗啉二磺酸钠（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉二磺酸）	Sigma-Aldrich	B1375
C57BL/6 小鼠（Mus musculus）	Charles River Laboratories
羰基铁粉，≥99.5%	Sigma-Aldrich	44890
聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）一次性比色皿	VWR	634-0678P
双蒸无菌水	B. Braun	0082479E
荧光酶标仪	BioTek Instruments	FLx800
盐酸，37%	Sigma-Aldrich	258148
微波消解炉及白色聚四氟乙烯消解杯	CEM	MDS-2000
硝酸	Fisher Scientific	15687290
烘箱	Binder	ED115
啮齿类动物饲料	Harlan Laboratories	2014S	含铁 175 mg/kg 的 Teklad Global 14% 蛋白啮齿类维持饲料
海鲈鱼（Dicentrarchus labrax）	Sonrionansa
海鲈鱼饲料	Skretting	L-2 Alterna 1P
单光束紫外-可见分光光度计	Shimadzu	UV mini 1240
巯基乙酸	Merck	100700
三氯乙酸	Merck	100807