吸收陷窝实验：一种利用磷酸钙包被培养板在体外定量成熟破骨细胞钙吸收活性的技术

摘要

来源：Cen, W., 等 一种简单的陷窝实验方案用于可视化和定量破骨细胞吸收活性 体外. 视频实验杂志 (2022)

在本视频中，我们描述了一种 体外 在涂有磷酸钙的细胞培养板上，利用人外周血单个核细胞分化的破骨细胞进行破骨细胞骨吸收活性检测。破骨细胞在细胞培养板的磷酸钙涂层基质上形成特征性的肌动蛋白环结构，并降解肌动蛋白环区域内的基质，释放钙离子和磷酸根离子，从而在被降解的基质中形成清晰可辨的吸收陷窝。

方案

所有涉及人类受试者的操作均按照机构、国家及国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 破骨细胞前体细胞的扩增

1. 用含20 ng/mL M-CSF的完全α-MEM培养基（10% FBS，1%青霉素-链霉素，1%两性霉素B）重悬PBMCs。以2.5 × 10⁵ 个细胞/cm²的密度接种PBMCs。通常，从15–20 mL新鲜血液中分离的细胞可接种于一个75 cm²培养瓶中（1.5–2 × 10⁷ 个细胞）。
2. 每隔三天用含20 ng/mL M-CSF的新鲜完全α-MEM培养基更换培养液，直至贴壁细胞达到所需融合度。当细胞融合度为95%时，典型产量为每瓶1.5–2 × 10⁶ 个细胞。通常扩增周期持续6天。
   注意： 前体细胞的成骨细胞分化潜能可能随着培养时间延长而降低。

2. 在磷酸钙包被板中诱导破骨细胞生成

1. 为促进细胞黏附，将磷酸钙（CaP）包被的培养板与 50 μL 胎牛血清（FBS）在 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
2. 为分离破骨细胞前体细胞，用 PBS 洗涤培养瓶两次以去除死亡或非黏附细胞。每 75 cm² 培养瓶加入 4 mL 胰蛋白酶（材料表），作用 30 分钟。
   1. 加入 4 mL 完全 α-MEM 培养基以终止消化，用细胞刮小心刮下细胞，并将细胞转移至 50 mL 离心管中。
   2. 使用血球计数板（Neubauer 计数室）或类似设备测定总细胞数。
3. 在 350 × g 条件下离心 7 分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于足量的完全 α-MEM 培养基中，其中含 20 ng/mL M-CSF 和 20 ng/mL RANKL，调整细胞浓度至 1 × 10⁶ 个细胞/mL。
4. 吸除 CaP 包被的 96 孔板中的 FBS 溶液，每孔加入 200 μL 细胞悬液（每孔含 2 × 10⁵ 个细胞）。
5. 根据实验设计需求，将破骨细胞前体细胞孵育相应时间或加入相应试剂。通常在孵育 6 天后可观察到大量体积较大且多核的破骨细胞，并可见吸收陷窝形成。每隔三天更换一次新鲜的完全 α-MEM 培养基，其中含 20 ng/mL M-CSF 和 20 ng/mL RANKL。
6. 孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞两次，加入 4% 多聚甲醛固定 10 分钟，再用 PBS 洗涤一次。
7. 固定后的破骨细胞可直接用于荧光染色，或于 4 °C 保存备用。

3. 破骨细胞的荧光染色与磷酸钙涂层

1. 将固定后的细胞用透化缓冲液（PBS 中含 0.1% Triton）孵育 5 分钟。
2. 加入 100 μL 用 PBS 配制的 AlexaFluor 546 标记的鬼笔环肽溶液，孵育 30 分钟以染色肌动蛋白纤维，随后吸除染色液。再加入 100 μL Hoechst 33342 染色液（10 μg/mL 溶于 PBS）孵育 10 分钟以染色细胞核。也可使用 DAPI 进行细胞核染色。
3. 加入 100 μL 用 PBS 配制的 10 μM 钙黄绿素溶液，孵育 10 分钟以染色 CaP 涂层。用 PBS 洗涤三次后进行成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α-MEM	Gibco	32561-029	MEM α 液体培养基，含 GlutaMAX，不含核苷
两性霉素 B	Biochrom	03-028-1B	两性霉素 B 溶液
钙黄绿素	Sigma-Aldrich	C0875	钙黄绿素
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	胎牛血清
固定缓冲液	Biolegend	420801	多聚甲醛
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	重组人 M-CSF
PBS	Lonza	17-512F	杜氏磷酸盐缓冲液（1×），不含钙和镁
青霉素-链霉素溶液	Lonza	DE17-602E	青霉素-链霉素混合液
鬼笔环肽-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 标记鬼笔环肽
RANKL	PeproTech	310-01	重组人可溶性 RANK 配体（大肠杆菌表达）
曲拉通 X-100	Sigma-Aldrich	T8787	烷基酚聚氧乙烯醚
TrypLE Express	Gibco	12605010	重组细胞解离酶