培养细胞中的底物氧化检测：一种通过测量被捕获的放射性CO2信号来定量细胞内底物氧化的体外检测方法

摘要

来源：Song, C. 等 评估能量底物氧化 体外 与 ¹⁴CO₂ 捕获 J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了一种利用¹⁴C放射性标记底物来定量底物氧化过程中释放的CO₂的技术。释放的¹⁴CO₂被碱性溶液捕获，并通过闪烁计数器进行定量。不同底物的氧化在不同组织之间存在差异，并反映组织的病理生理状态。

方案

使用放射性材料（RAM）需事先获得各机构指定安全委员会的批准。

1. ¹⁴C标记底物储备液的制备

1. 通过将 11 g 牛血清白蛋白（BSA）与 33.1 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）混合，并在室温下轻轻摇动约 3 小时，直至 BSA 完全溶解，制备 4 mM BSA 储存液。使用前将 BSA 储存液在 70 °C 水浴中温育。
2. 在指定的放射性操作通风橱中，将 50 µCi ¹⁴C-油酸（50 µCi/µmol，溶于乙醇）置于敞口瓶中干燥 8 小时。加入 312.5 µL H₂O，再加入 3.5 mg（11.5 µmol）油酸钠，充分混匀。
3. 将所得溶液在水浴中加热至 70 °C，加入 0.9375 mL 预先温育的 BSA 储存液，得到 10 mM 标记油酸储存液（其中 ¹⁴C-油酸与未标记油酸的摩尔比为 1:11.5）。分装储存液，于 -20 °C 保存以供长期使用。
4. ¹⁴C-葡萄糖和 ¹⁴C-谷氨酰胺在解冻后直接使用。

2. 含¹⁴C标记底物的培养基制备

注意：为确保培养基中能量底....

结果

图1：CO₂捕获测定与颅盖骨解剖示意图。（A）颅盖骨的中部区域（以橙色虚线三角形标示）被取下用于细胞分离。（B）使用1.5 mL微量离心管进行CO₂捕获（步骤1）。将滤纸（为图示目的以蓝色表示）裁剪至适合放入管盖内（步骤2）。向每管中加入400 µL细胞培养热培养基和200 µL 1 M高氯酸，并在滤纸上加入20 µL NaOH（步骤3），然后盖紧管盖（步骤4）。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 滤膜	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	用于过滤 BSA 溶液
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056	从细胞培养<br/> 培养板中解离细胞
1.5 mL 离心管	PR1MA	PR MCT17 RB	用于反应孵育
10 cm 培养皿	TPP	93100	用于细胞培养
10 mL 注射器	BD	302995	用于冲洗长<br/> 骨中的骨髓
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	用于细胞培养基的配制
14C-葡萄糖	PerkinElmer	NEC042X050UC	用于制备放射性标记培养基（hot media）
14 C-谷氨酰胺	PerkinElmer	NEC451050UC	用于制备放射性标记培养基（hot media）
14 C-油酸	PerkinElmer	NEC317050UC	用于制备放射性标记培养基（hot media）
23 G 针头	BD	305120	用于冲洗长<br/> 骨中的骨髓
24 孔板	TPP	92024	用于细胞培养
70 &mu;m 细胞筛	MIDSCI	70CELL	用于颅骨消化过程中<br/> 上清液的过滤
吖啶橙/碘化丙啶<br/> （AO/PI）染料	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	对活细胞进行染色以确定接种<br/> 密度
牛血清白蛋白	Proliant Biologicals	68700	用于脂肪酸偶联
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		测定活细胞数量
离心机	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	用于细胞沉淀
II 型胶原酶	Worthington	LS004176	从组织中解离细胞
定制 MEM α	GIBCO	SKU: ME 18459P1	用于配制定制放射性标记培养基（hot media）
杜氏磷酸盐缓冲<br/> 盐水	Gibco	10010023	用于溶解和稀释试剂，<br/> 以及清洗培养皿
滤纸	Millipore-Sigma	WHA1001090	利用氢氧化钠捕获 CO₂
葡萄糖	Sigma-Aldrich	g7528	用于配制定制培养基
HEPES	Gibco	15630080	在细胞培养过程中捕获 CO₂
L-肉碱	Sigma-Aldrich	C0283	补充用于脂肪酸氧化
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	g3126	用于配制定制培养基
MEM α	Thermo	A10490	细胞培养基
封口膜	Pecheney Plastic Packaging	PM998	用于密封细胞培养皿
青霉素-链霉素	Thermo Fisher	15140122	防止细胞培养中的污染
高氯酸	Sigma-Aldrich	244252	在代谢<br/> 测定中释放 CO₂
丙酮酸	Sigma-Aldrich	p5280	用于配制定制培养基
液体闪烁计数仪	Beckman Coulter	LS6500	测定滤纸上的放射性<br/> 强度
闪烁液	MP Biomedicals	882453	吸收放射性同位素释放的能量<br/> 并以光脉冲形式重新发射
闪烁瓶	Fisher Scientific	03-337-1	用于盛装闪烁<br/> 液的反应容器
碳酸钠	Sigma-Aldrich	S5761	用于培养基的缓冲平衡
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	58045	在代谢测定中捕获 CO₂
油酸钠	SANTA CRUZ	SC-215879	与 BSA 偶联的脂肪酸<br/> 制备
真空过滤装置 1000	TPP	99950	过滤 cMEM&alpha;