培养细胞中的底物氧化检测：一种通过测量被捕获的放射性CO2信号来定量细胞内底物氧化的体外检测方法

摘要

来源：Song, C. 等 评估能量底物氧化 体外 与 ¹⁴CO₂ 捕获 J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了一种利用¹⁴C放射性标记底物来定量底物氧化过程中释放的CO₂的技术。释放的¹⁴CO₂被碱性溶液捕获，并通过闪烁计数器进行定量。不同底物的氧化在不同组织之间存在差异，并反映组织的病理生理状态。

方案

使用放射性材料（RAM）需事先获得各机构指定安全委员会的批准。

1. ¹⁴C标记底物储备液的制备

1. 通过将 11 g 牛血清白蛋白（BSA）与 33.1 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）混合，并在室温下轻轻摇动约 3 小时，直至 BSA 完全溶解，制备 4 mM BSA 储存液。使用前将 BSA 储存液在 70 °C 水浴中温育。
2. 在指定的放射性操作通风橱中，将 50 µCi ¹⁴C-油酸（50 µCi/µmol，溶于乙醇）置于敞口瓶中干燥 8 小时。加入 312.5 µL H₂O，再加入 3.5 mg（11.5 µmol）油酸钠，充分混匀。
3. 将所得溶液在水浴中加热至 70 °C，加入 0.9375 mL 预先温育的 BSA 储存液，得到 10 mM 标记油酸储存液（其中 ¹⁴C-油酸与未标记油酸的摩尔比为 1:11.5）。分装储存液，于 -20 °C 保存以供长期使用。
4. ¹⁴C-葡萄糖和 ¹⁴C-谷氨酰胺在解冻后直接使用。

2. 含¹⁴C标记底物的培养基制备

注意：为确保培养基中能量底物浓度的可靠性，必须使用定制培养基，并在使用前立即添加新鲜底物。此处使用的是不含葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺、酚红和碳酸氢钠的定制最低必需培养基（MEMα）。然而，应针对每种细胞类型确定最适培养基。

1. 将 8.67 g 培养基粉末溶解于 1 L 纯化水中。加入 2.2 g 碳酸氢钠以达到 pH 7.4，并使用 0.22 µm 真空过滤装置过滤溶液。
2. 添加新鲜成分，制备完全培养基（cMEMα），使其终浓度为 5.5 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸和 10% 胎牛血清（FBS）。进一步向 cMEMα 中补充 100 mM L-肉碱和 10 µM HEPES，以促进脂肪酸氧化。
3. 使用前立即向新配制的 cMEMα 中加入 ¹⁴C 标记底物，制成标记培养基。制备油酸标记培养基时，将 10 mM 标记油酸储备液按 1:100 稀释加入 cMEMα，使油酸终浓度为 100 µM（终放射活性为 0.4 µCi/mL）。
   注意： 使用含 1:11.5 标记/非标记油酸比例的 10 mM 标记油酸储备液（见步骤 2.4），可在最小化放射性物质用量的同时，在培养基中实现 100 µM 总油酸的生理浓度。
4. 制备 10 mM 未标记油酸储备液：将 24.36 mg 油酸钠加入 2 mL H₂O 中，在 70 °C 水浴中加热约 20 分钟至完全溶解，迅速与 6 mL 预热至 70 °C 的 4 mM BSA 储备液混合。转移至 37 °C 水浴中孵育 1 小时，并通过 0.22 µm 滤器过滤。分装后于 -20 °C 保存以供长期使用。
5. 制备葡萄糖标记培养基时，加入 ¹⁴C-葡萄糖至终浓度为 1.333 µM（1:4,125 稀释，终放射活性为 0.4 µCi/mL）。制备谷氨酰胺标记培养基时，加入 ¹⁴C-谷氨酰胺至终浓度为 2 µM（1:1,000 稀释，终放射活性为 0.4 µCi/mL）。
6. 向葡萄糖和谷氨酰胺标记培养基中加入步骤 2.4 制备的 10 mM 未标记油酸储备液，使油酸终浓度达到 100 µM，与油酸标记培养基中的浓度一致。

3. 细胞的制备

注意：此处以颅骨前成骨细胞和骨髓巨噬细胞为例。用户应根据适当的实验方案制备所需类型的细胞。胶原酶II的消化浓度需在预实验中进行优化，因其酶活性可能因不同批次而异。

1. 颅骨成骨前体细胞的分离与培养
   1. 通过断头法处死出生后第3至5天（P3-5）的小鼠幼崽，并将其转移至含有青霉素-链霉素（P/S）的冰冻DPBS中。
   2. 去除皮肤和软组织以暴露颅骨。在DPBS中从前向后切除周围组织，收集颅骨中部区域（图1A）。使用镊子轻轻刮擦颅骨的内表面和外表面，以促进后续消化时细胞的释放。
   3. 在DPBS中配制2 mg/mL和4 mg/mL的II型胶原酶溶液，并使用新的0.22 µm滤器过滤每种溶液。首先用2 mg/mL胶原酶溶液消化清洗后的颅骨15分钟，弃去消化液。再用4 mg/mL胶原酶溶液对清洗后的样本进行三次消化，每次15分钟，每次消化后的溶液均收集并保存。
   4. 将消化液通过70 µm细胞筛过滤，并在300 × g 条件下离心5分钟。将细胞沉淀重悬于含10% FBS和P/S的cMEMα培养基中（见步骤2.2）。
   5. 计数后以4 × 10⁴ 个细胞/cm² 的密度接种于10 cm培养皿中。在37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养3天。
   6. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下解离细胞。计数后将细胞以7.5 × 10⁵/cm² 的密度接种于24孔细胞培养板中，培养基为含10% FBS和P/S的cMEMα。每种细胞类型在每种基质上至少接种4个孔，每种细胞类型还需额外接种至少三个孔用于实验前的细胞计数。
   7. 在进行基质氧化实验前，于37 °C培养过夜。
2. 骨髓来源巨噬细胞（BMMs）的分离与培养
   注意：BMMs的培养需要巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），该因子可作为重组蛋白商业购买。本实验采用经基因工程改造可表达M-CSF的CMG14-12细胞系的条件培养基，作为经济替代方案。
   1. 从8周龄小鼠中取出股骨和胫骨，去除肌肉和结缔组织。用锋利的剪刀剪去骨的两端并弃去。
   2. 使用配备23 G针头的注射器，将一根股骨和一根胫骨中的骨髓冲洗至10 cm培养皿中，冲洗液为含10% FBS、P/S和10% CMG14-12条件培养基（BMM培养基）的15 mL cMEMα。将细胞置于培养皿中，在37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。
   3. 培养3天后，弃去培养液，用DPBS洗涤。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化5分钟，使贴壁细胞解离。离心后将细胞沉淀重悬于BMM培养基中。
   4. 计数后以7.5 × 10⁵/cm² 的密度接种于24孔细胞培养板中，方法同3.1.6所述。在开始实验前，于BMM培养基中在37 °C下培养过夜。

4. 带有CO₂捕获装置的底物氧化测定

注意：应针对每种细胞类型确定合适的接种密度，以在实验开始前达到80-90%的融合度。请注意，细胞密度可能影响细胞的代谢状态。

1. 用 DPBS 将额外孔中的细胞洗涤两次。用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，并将 20 µL 重悬于 DPBS 中的细胞与 20 µL 吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）即用型商用染色液混合。使用自动细胞计数仪测定活细胞数量，并记录该数值用于最终计算。
2. 用 DPBS 将检测孔中的细胞洗涤两次。在 RAM 指定的组织培养罩内，向每个检测孔中加入 500 µL 预热的培养基。用封口膜密封培养板，并将细胞置于 RAM 指定的 37 °C 培养箱中孵育 4 小时。
3. 在孵育期间，将滤纸剪成略大于 1.5 ml 微量离心管管盖内部区域的圆形片状，并将其紧密插入管盖内（图 1B）。向每根离心管中加入 200 µL 1 M 高氯酸，并向管盖内装入的滤纸上加入 20 µL 氢氧化钠。
4. 细胞孵育结束后，将每孔中的 400 µL 培养基转移至已准备好的离心管中，并立即盖紧管盖。将离心管置于室温下的试管架中静置 1 小时。
5. 在静置期间，为每根离心管准备一个闪烁瓶，并向其中加入 4 mL 闪烁液。将每片滤纸转移至对应的闪烁瓶中，并在室温下孵育 30 分钟。
6. 对组织培养罩、水浴锅（用于 ¹⁴C-油酸制备）、冰箱、培养箱、水槽、地面以及任何其他工作区域进行擦拭测试，以检测是否存在 RAM 污染。将擦拭用的滤纸放入含有闪烁液的闪烁瓶中。
7. 使用闪烁计数器测量闪烁瓶中的 ¹⁴C 放射性活度。记录读数结果。如有必要，根据辐射安全指南对工作环境进行去污处理。

结果

图1：CO₂捕获测定与颅盖骨解剖示意图。（A）颅盖骨的中部区域（以橙色虚线三角形标示）被取下用于细胞分离。（B）使用1.5 mL微量离心管进行CO₂捕获（步骤1）。将滤纸（为图示目的以蓝色表示）裁剪至适合放入管盖内（步骤2）。向每管中加入400 µL细胞培养热培养基和200 µL 1 M高氯酸，并在滤纸上加入20 µL NaOH（步骤3），然后盖紧管盖（步骤4）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 滤膜	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	用于过滤 BSA 溶液
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056	从细胞培养<br/> 培养板中解离细胞
1.5 mL 离心管	PR1MA	PR MCT17 RB	用于反应孵育
10 cm 培养皿	TPP	93100	用于细胞培养
10 mL 注射器	BD	302995	用于冲洗长<br/> 骨中的骨髓
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	用于细胞培养基的配制
14C-葡萄糖	PerkinElmer	NEC042X050UC	用于制备放射性标记培养基（hot media）
14 C-谷氨酰胺	PerkinElmer	NEC451050UC	用于制备放射性标记培养基（hot media）
14 C-油酸	PerkinElmer	NEC317050UC	用于制备放射性标记培养基（hot media）
23 G 针头	BD	305120	用于冲洗长<br/> 骨中的骨髓
24 孔板	TPP	92024	用于细胞培养
70 &mu;m 细胞筛	MIDSCI	70CELL	用于颅骨消化过程中<br/> 上清液的过滤
吖啶橙/碘化丙啶<br/> （AO/PI）染料	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	对活细胞进行染色以确定接种<br/> 密度
牛血清白蛋白	Proliant Biologicals	68700	用于脂肪酸偶联
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		测定活细胞数量
离心机	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	用于细胞沉淀
II 型胶原酶	Worthington	LS004176	从组织中解离细胞
定制 MEM α	GIBCO	SKU: ME 18459P1	用于配制定制放射性标记培养基（hot media）
杜氏磷酸盐缓冲<br/> 盐水	Gibco	10010023	用于溶解和稀释试剂，<br/> 以及清洗培养皿
滤纸	Millipore-Sigma	WHA1001090	利用氢氧化钠捕获 CO₂
葡萄糖	Sigma-Aldrich	g7528	用于配制定制培养基
HEPES	Gibco	15630080	在细胞培养过程中捕获 CO₂
L-肉碱	Sigma-Aldrich	C0283	补充用于脂肪酸氧化
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	g3126	用于配制定制培养基
MEM α	Thermo	A10490	细胞培养基
封口膜	Pecheney Plastic Packaging	PM998	用于密封细胞培养皿
青霉素-链霉素	Thermo Fisher	15140122	防止细胞培养中的污染
高氯酸	Sigma-Aldrich	244252	在代谢<br/> 测定中释放 CO₂
丙酮酸	Sigma-Aldrich	p5280	用于配制定制培养基
液体闪烁计数仪	Beckman Coulter	LS6500	测定滤纸上的放射性<br/> 强度
闪烁液	MP Biomedicals	882453	吸收放射性同位素释放的能量<br/> 并以光脉冲形式重新发射
闪烁瓶	Fisher Scientific	03-337-1	用于盛装闪烁<br/> 液的反应容器
碳酸钠	Sigma-Aldrich	S5761	用于培养基的缓冲平衡
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	58045	在代谢测定中捕获 CO₂
油酸钠	SANTA CRUZ	SC-215879	与 BSA 偶联的脂肪酸<br/> 制备
真空过滤装置 1000	TPP	99950	过滤 cMEM&alpha;