蛋白质相分离检测：一种用于斑马鱼幼虫脊髓运动神经元中突变RNA结合蛋白相分离的光遗传学方法

摘要

来源：Asakawa, K. 等. 斑马鱼幼体脊髓运动神经元中TDP-43的光遗传相变. J. Vis. Exp. (2022)

在本视频中，我们介绍了一种相分离检测方法，该方法通过诱导含有内在无序区域并与光敏寡聚化结构域融合的细胞内蛋白质发生相分离 通过 蓝光照射下发生自缔合，形成无膜的类液体凝聚物。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核

1. 蓝光照射用LED的准备

1. 使用安装在平板电脑或手机上的配套应用程序打开 LED 面板。将光谱仪的探头插入 6 孔板的一个空孔中，通过应用程序将 LED 光源调节至峰值波长约为 456 nm。将光学功率计的光学传感器置于该空孔内，调节 LED 光源的功率至约 0.61 mW/cm²。LED 光源的设置可在应用程序中保存并随时调用。
2. 将已设定好的培养皿/LED 面板放入 28 °C 的培养箱中。此步骤需在鱼胚胎成像开始前（即 48 hpf 之前）完成。

2. 表达光遗传学TDP-43的斑马鱼幼鱼成像

1. 使用配备 Plan-Neofluar 5x/0.15 物镜的落射荧光显微镜，根据脊髓运动神经元柱中 RFP（opTDP-43h）或 EGFP（EGFP-TDP-43z）的荧光，选择至少在 47 hpf 之前的 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 双转基因鱼。
2. 对 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 双转基因鱼进行去壳处理。
3. 将含有 250 µg/mL 三卡因甲磺酸盐（ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt）的 1% 低熔点温度琼脂糖在 42 °C 下预热。
4. 在含有相同浓度三卡因的 E3 缓冲液中，短暂麻醉 48 hpf 的 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] 双转基因鱼。
5. 在室温下的玻璃培养皿上滴加一滴预热的 1% 低熔点温度琼脂糖，使其形成直径为 8–10 mm 的圆顶状琼脂糖滴。
6. 使用巴斯德移液管将麻醉后的鱼转移至玻璃培养皿中的低熔点温度琼脂糖上，然后反复吹打数次使其混合均匀。尽量减少随鱼一同加入琼脂糖中的 E3 缓冲液体积。
7. 在琼脂糖凝固过程中（通常约 1 分钟），使用注射器针头将鱼体保持侧卧位，以确保脊髓处于适当的水平位置。琼脂糖凝固后，在圆顶状琼脂糖包埋的鱼体上滴加数滴 E3 缓冲液。
8. 使用配备数值孔径为 1.00 的 20x 水浸物镜的共聚焦显微镜，以每像素 4.0 µs（12 位/像素）的扫描速度、每层 1.0 µm 的步长，以及以下激发/发射波长组合：通道 1）473/510 nm 用于 EGFP，通道 2）559/583 nm 用于 mRFP1，对脊髓进行连续共聚焦 z 轴扫描成像。
   注意：在感兴趣区域（ROI）中应包含鱼腹侧的肛门作为参考，以便在不同时间点识别和比较脊髓节段（水平 16–17）。
9. 成像完成后，立即用注射器针头小心划破琼脂糖，将鱼取出。尽量缩短鱼在琼脂糖中的包埋时间，尽管包埋时间少于 <30 分钟不会影响鱼的存活率。

3. 通过蓝色发光二极管（LED）光源的场照明对表达opTDP-43h的鱼类进行光刺激

1. 向孔中加入 7.5 mL 的 E3 缓冲液，并将已成像的 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 双转基因鱼放入孔中。使用间隔物（例如，堆叠的五片载玻片）将六孔板与 LED 面板保持 5 mm 的距离，并将六孔板放置在 LED 面板上。
2. 打开蓝色 LED 灯。当需要未照射的对照鱼（即在黑暗条件下）时，将部分 Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] 双转基因鱼置于另一个用铝箔覆盖的六孔板中。
3. 照射结束后（例如，如 图 1 所示在 72 hpf 时照射 24 小时），通过重复步骤 2.3 - 2.9 对照射过的鱼的脊髓进行成像。

结果

图 1：光刺激前后 opTDP-43h 与 EGFP-TDP-43z 的比值比较。 （A）根据 EGFP-TDP-43z 信号在 48 hpf 和 72 hpf 时圈选出四个 mnr2b 阳性单细胞的胞体区域（ROI），图中以品红色显示。矩形 ROI（bg）用于扣除背景信号（背景 ROI）。图像改编自 Asakawa et al。 （B）在每个时间点，将每个细胞中 opTDP-43h 相对于 EGFP-TDP-43z 的强度以 RFP/GFP 比值形式绘图。带星号标注的细胞 #1 因其 EG...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
共聚焦显微镜	Olympus	FV1200
落射荧光显微镜	ZEISS	Axioimager Z1
荧光体视显微镜	Leica	MZ16FA
玻璃底培养皿	IWAKI	3910-035
培养箱	MEE	CN-25C
LED 面板	Nanoleaf Limited	Nanoleaf AURORA smarter kit
物镜	Olympus	XLUMPlanFL N 20×/1.00
物镜	ZEISS	Plan-Neofluar 5x/0.15
光功率计	HIOKI	3664
光学传感器	HIOKI	9742-10
六孔板	FALCON	353046
光谱仪探头 BLUE-Wave	StellerNet Inc.	VIS-50
注射器针头	TERUMO	NN-2725R
Tricane	Sigma-Aldrich	A5040
NuSieve GTG 琼脂糖	LONZA	50181