小分子杀线虫剂筛选实验：一种针对 Ditylenchus dipsaci 的中通量潜在杀线虫剂筛选方法

摘要

来源：Cammalleri, S. R.，等。植物寄生线虫 Ditylenchus dipsaci 的培养与筛选。视觉化实验杂志 (2022)。

在本视频中，我们展示了一种筛选试验，用于评估小分子杀线虫剂对线虫的杀灭效果。若经药物处理后，样品中活动性线虫数量减少，则认为该杀线虫剂有效。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核

1. 体外 小分子筛选

1. 按照以下步骤准备检测板。
   1. 将灭菌蒸馏水倒入无菌槽中，使用多通道移液器从槽中向平底96孔板的每个孔中加入40 µL蒸馏水。
2. 准备点样工具并添加化学品。
   1. 在实验台上的本生灯火焰附近设置点样托盘（见材料表）。依次向各点样托盘中加入：25 mL点样针清洁液、35 mL 50% DMSO（溶于水）、45 mL蒸馏水、55 mL 70%乙醇和65 mL 95%乙醇。在每个托盘前方放置一张吸水纸。
   2. 将点样针浸入清洁液中，上下移动3次（3x）以清洁点样工具。在本方案中，“3x”和“10x”分别定义为将点样针在溶液中上下移动三次或十次。用前方的吸水纸吸干点样针。重复此操作一次。
      1. 接着，用蒸馏水冲洗点样针3次，然后吸干。重复该步骤一次。
      2. 最后，用95%乙醇冲洗点样针3次，然后吸干。重复一次。用火焰灼烧点样针，并使乙醇完全挥发。
   3. 通过将点样针在化学品储存板中点样3次，再转移至检测板中点样10次，将化学品从96孔化学品储存板加入检测板。点样后在清洁液前方的吸水纸上吸干。
   4. 每完成一块板后，按以下顺序清洗点样针，每次清洗之间均在吸水纸上吸干：50% DMSO中清洗3次（一次）、蒸馏水中清洗3次（一次）、75%乙醇中清洗3次（一次）、95%乙醇中清洗3次（两次）。用火焰灼烧点样针，并使乙醇完全挥发。
   5. 完成所有点样操作后，重复步骤1.2.2。
      注意：筛选实验的终浓度为60 µM。
3. 添加线虫
   1. 首先将收集的线虫重悬，然后使用低吸附枪头吸取5 µL样品滴加到载玻片上，在解剖显微镜下计数5 µL中的线虫数量。
      1. 用无菌蒸馏水将线虫浓度调整至2条/µL。使用多通道移液器和储液槽，向96孔板的每个孔中加入10 µL（约20条线虫）。
         注意：采用所述的培养与收集方法，每块培养板可收集约15,000条D. dipsaci线虫。每孔使用20条线虫，因其数量较少，便于清晰观察和统计活动与不活动个体。
   2. 用实验室封口膜密封板孔，并用湿纸巾包裹。将板放入盒子中，固定在粘性垫上，置于设定为200 rpm振荡、温度20°C的恒温振荡培养箱中。通过额外添加湿纸巾确保板在盒内稳定，减少移动。

2. 数据收集与分析

1. 在第5天在解剖显微镜下观察平板。计数DMSO溶剂对照组和药物处理孔中可移动的以及总的 D. dipsaci 数量。
   1. 如果线虫活动性较低，向孔中加入2 µL 1 M NaOH，使其终浓度达到40 mM，以刺激其运动。
      注意：加入NaOH后，线虫将立即开始移动，需在5分钟内完成观察。可移动线虫数量与总线虫数量将用于计算可移动线虫的比例。该实验的持续时间可根据筛选目的进行调整。
2. 计算可移动线虫的比例。在 D. dipsaci 筛选中，重复实验中始终产生0%可移动线虫的孔被归类为强阳性结果。
   注意：应避免将平板长时间放置在解剖显微镜载物台上，因为光源可能加热平板，从而对生物测定产生不一致的影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 烧杯	Pyrex	CLS100050
96 孔板	Sarstedt	83.3924
铝箔	Alcan Plus
体视显微镜	Leica	Leica MZ75
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-500ML
载玻片	MAGNA	60-1200
无尘擦拭纸	V&P Scientific	VP 522-100
低吸附移液器吸头（200 µL）	LABFORCE	1159M44
多通道移液器	Eppendorf research plus	3125000036
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045-500G
封口膜	Bemis	PM-996
针头清洗液	V&P Scientific	VP110A
点样针	V&P Scientific	VP381N
点样针冲洗槽	V&P Scientific	VP 421
带盖试剂槽（用于多通道移液器）	Sigma-Aldrich	BR703459
摇床培养箱	New Brunswick Scientific	I26