来源：Kampleitner, C. 等. 用于骨再生的生物材料生物学相容性评价。J. Vis. Exp. (2018)
在本视频中，我们介绍一种利用阴离子染料茜素红S检测成骨细胞分泌的钙沉积物的方法。培养的成骨细胞首先经染色处理，随后回收染料，通过比色法对钙沉积物进行定量分析，以评估成骨细胞矿化的程度。
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方法文章
体外矿化检测：通过茜素红S染色与提取进行比色法定量分析骨移植替代材料上成骨细胞钙沉积
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 成骨细胞矿化实验
- 在添加成骨细胞（OBs）之前，将直径为14 mm的β-磷酸三钙（β-TCP）圆片预先置于24孔悬浮培养板中，每孔加入1 mL骨生长培养基（BGM），在37 °C、5% CO₂条件下预孵育24小时。对照组使用标准组织培养板，而生物材料样品使用悬浮培养板，以避免细胞贴附于塑料表面。
- 吸除预孵育培养基，将原代小鼠OBs重悬于BGM中。按照8.8 × 10⁴ OBs/cm²的密度，将细胞接种至预孵育后的β-TCP圆片上，置于24孔悬浮培养板中；对照组则接种于24孔组织培养板中（每孔1 mL）。OBs将贴附于组织培养板或生物材料样品表面。
- 接种OBs后24小时，弃去BGM，更换为含BGM、50 µg/mL抗坏血酸和5 mM β-甘油磷酸钠的成骨矿化培养基（MM），每孔1 mL，在37 °C、5% CO₂条件下继续培养14天。每隔2–3天更换一次培养基，每孔加入1 mL新鲜配制的MM。
2. 通过茜素红S（ARS）染色评估成骨细胞矿化
- 在加入成骨诱导培养基（MM）14天后，吸除含有原代成骨细胞（OBs）的孔中培养液，用0.5 mL 1× PBS在室温下清洗两次。吸除PBS，加入0.5 mL 10%中性缓冲福尔马林溶液，在室温下固定细胞10分钟。
- 使用一次性移液器吸除10%中性缓冲福尔马林溶液，用0.5 mL超纯水清洗两次。
- 向固定的成骨细胞中加入0.25 mL溶于超纯水的40 mM茜素红S（ARS）染色液（pH 4.2），将培养板置于摇床上，室温孵育10分钟，摇速为每分钟100次。
- 使用一次性移液器吸除染色液，加入1 mL超纯水冲洗。重复此步骤5–10次，以去除非特异性染色。
注意：冲洗液应无颜色。 - 吸除超纯水，加入1 mL冷PBS。将培养板置于摇床上，室温孵育10分钟，摇速为每分钟100次。
- 吸除PBS，将染色后的β-磷酸三钙（β-TCP）圆片转移至新孔中，使用平板扫描仪扫描培养板以记录矿化情况。
- 加入0.25 mL 10%氯化十六烷基吡啶溶液，将培养板置于摇床上，室温孵育15分钟，摇速为每分钟100次，以提取ARS染料。
- 将上清液转移至1.5 mL离心管中，在室温下以17,000 × g 离心5分钟。
- 用10%氯化十六烷基吡啶溶液将提取物按1:10–1:20的比例稀释，取300 µL加入96孔板中，包括两个仅含10%氯化十六烷基吡啶溶液的空白孔。
- 通过将40 mM ARS染色液（pH 4.2）用10%氯化十六烷基吡啶溶液稀释，配制浓度范围为4至400 µM的7个ARS标准品，用于绘制标准曲线。
- 将参考标准品每孔300 µL重复加入96孔板中。
- 在520 nm波长下测定样品、空白孔及参考标准品的吸光度。
- 从参考标准品和样品的读数中减去空白孔的读数。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| β-磷酸三钙圆盘（β- TCP，14 mm | 将圆片置于马弗炉中，在1150 ℃温度下进行烧结 °C. 样品在用于细胞培养前需进行紫外照射（每面照射15分钟） | ||
| 茜素红 S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| 骨生长培养基（BGM） | α- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素/链霉素 | ||
| 10% 中性缓冲福尔马林溶液 | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 十六烷基吡啶氯化物一水合物 | Sigma-Aldrich | C9002 | |
| L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物 | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| MEM α 培养基（α-MEM | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| 成骨矿化培养基（MM） | α- MEM + 10% 热灭活 FBS + 1% 青霉素-链霉素 + 50 µg/mL 抗坏血酸 + 5 mM β-甘油磷酸盐 | ||
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 1×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Gibco，赛默飞世尔科技 | 10010023 | |
| β二水合α-磷酸甘油钠盐 | Sigma-Aldrich | G5422 | |
| 超纯水：无热原细胞培养用水 | VWR | L0970-500 | |
| 96孔透明板 | Greiner bio-one | 655001 | |
| 24孔悬浮培养板 | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24孔组织培养板 | Greiner bio-one | 662160 | |
| 离心机：VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2培养箱：HeraCell 240 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 平板扫描仪：Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
| Infinite M200 Pro 微孔板读板仪 | Tecan | ||
| 微量离心管：Eppendorf管安全锁扣1.5 mL | VWR | 21008-959 | |
| 摇床培养箱 GFL3032 | GFL | 3032 | |
| 一次性移液管：血清移液管 | Greiner bio-one | 612301 |
