体外矿化测定:一种通过茜素红 S 染色和提取定量骨移植物替代物上成骨细胞钙沉积的比色法

摘要

来源:Kampleitner， C. et al. 骨再生生物材料的生物相容性概况。J. Vis. Exp. （2018）

在本视频中，我们描述了一种使用阴离子染料 Alizarin Red S 检测成骨细胞分泌的钙沉积物的方法。首先对培养的成骨细胞进行染色，然后回收染料以对钙沉积物或成骨细胞矿化程度进行比色定量。

方案

1. 成骨细胞矿化测定

1. 在添加成骨细胞 （OB） 之前，将直径为 14 mm 的 β-磷酸三钙 （β-TCP） 圆盘在 24 孔悬浮培养板中的 1 mL 骨生长培养基 （BGM） 中，在 37 °C 和 5% CO₂ 中预孵育 24 小时。对对照使用标准组织培养板，对生物材料样品使用悬浮培养板，以避免细胞附着在塑料上。
2. 吸出预孵育培养基，然后在 BGM 中重悬原代小鼠 OB。将 8.8 x 10⁴ OBs/cm² 添加到 24 孔悬浮培养板中预孵育的 β-TCP 圆盘上，对于对照组，添加到 24 孔组织培养板（1 mL/孔）中。OB 将附着在组织培养板或生物材料样品上。
3. 添加 OB 后 24 小时，用 1 mL 含有 BGM、50 μg/mL 抗坏血酸和 5 mM β-甘油磷酸酯的成骨矿化培养基 （MM） 替换 BGM，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 14 天。每 2-3 天更换一次培养基，向每个孔中加入 1 mL 新鲜制备的 MM。

2. 通过茜素红 S （ARS） 染色评估成骨细胞矿化

1. 加入 MM 后 14 天，从含有原代 OB 的孔中吸出培养基，并在室温下用 0.5 mL 的 1x PBS 冲洗两次。吸出 PBS 并通过在 RT 下加入 0.5 mL 的 10% 缓冲福尔马林溶液 10 分钟来固定细胞。
2. 用一次性移液管吸出 10% 缓冲福....

材料