用于早期血管生成评估的微珠出芽实验：一种体外微珠模型，用于研究周细胞存在条件下的内皮细胞出芽

摘要

来源：Azam, S. H. 等. 将周细胞整合到内皮细胞珠出芽实验中. 视觉化实验杂志 (2018).

本视频展示了一种改良的基于微载体珠的实验方法，该方法结合了周细胞以研究血管生成早期阶段的内皮细胞出芽。该实验提供了一种体外模型，用于理解血管生成的分子机制以及抗血管生成治疗药物的作用。

方案

1. 准备用于凝胶植入的微珠

1. 取含有包被了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和周细胞的微载体珠的培养物。
2. 在显微镜下使用20倍物镜检查含有微载体包被珠的培养皿，确保所有珠子均已被内皮细胞充分包被。
3. 用力吹打已接种的细胞溶液，使细胞从6 cm培养皿上脱离，并将溶液转移至离心管中。用完全培养基额外冲洗培养皿两次，并将冲洗液一并转移至同一离心管，以收集可能黏附在培养皿上的残留珠子。
   1. 避免引入气泡，并使用1000 µL移液枪以尽量减少对内皮细胞包被珠的剪切应力。
4. 静置3分钟，使溶液中的珠子沉降至离心管底部。
5. 使用1000 µL移液枪枪头尽可能吸除上清液，注意不要扰动管底的珠子沉淀（切勿使用真空抽吸装置）。
6. 向每根离心管中加入1 mL完全培养基，并重悬珠子。
7. 静置30–60秒，使珠子重新沉降至管底，然后使用1000 µL移液枪尽可能吸除上清液，注意不要扰动珠子沉淀。切勿使用真空抽吸装置，以免意外吸走珠子沉淀。
8. 重复步骤1.6和1.7共额外两次。目的是尽可能去除从6 cm培养皿上脱落的游离HUVEC，同时保留尽可能多的HUVEC包被珠；这些包被珠在圆底荧光激活细胞分选（FACS）管中的沉降速度应快于游离细胞。
9. 向珠子中加入1 mL完全培养基。

2. 将包被微珠嵌入纤维蛋白凝胶中

1. 使用 P1000 移液器尽可能吸出培养基，注意不要扰动每个 FACS 管中的珠粒沉淀。
2. 将珠粒重悬于 2.5 mL 纤维蛋白原溶液中。
3. 将 13 µL 凝血酶溶液加入 24 孔玻璃底板的各个目标孔中。使用玻璃底板对于实现血管 sprout 的最佳成像至关重要。
   注意：在进行下一步操作前，凝血酶在孔中静置时间不得超过 5–10 分钟。
4. 向每个孔中加入 0.5 mL 珠粒/纤维蛋白原混合溶液。
   1. 每次移液前，务必充分重悬珠粒溶液。
   2. 小心地将移液枪头直接插入已含有凝血酶的孔中，缓慢上下吹打 2–3 次以充分混匀溶液，注意避免引入气泡。
   3. 每更换一个孔时，务必更换移液枪头。
   4. 在初始纤维蛋白凝胶形成过程中，切勿移动或扰动培养板，任何移动均可能破坏凝胶的形成。
5. 将培养板置于生物安全柜中，室温静置 30 分钟。
6. 小心将培养板转移至 37 °C 培养箱中，继续孵育 1.5–2 小时，使凝胶完全固化。

3. 在纤维蛋白凝胶上接种成纤维细胞

1. 在凝胶凝固的最后30分钟内，按以下步骤分离正常人肺成纤维细胞（NHLF）：
   1. 用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一个T175培养瓶中的细胞，然后加入5 mL细胞解离溶液，在37 °C孵育10分钟。
   2. 将NHLF细胞以20,000个细胞/mL的浓度重悬于完全培养基中。
      注意：NHLF细胞可在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。
2. 将1 mL NHLF细胞悬液接种至每个孔的凝胶表面，并将培养板放回培养箱中。
3. 在实验期间每隔一天更换一次完全培养基。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌移液器吸头	VWR
移液器	Eppendorf
EGM2完全培养基子弹套装	Lonza	CC-3162	HUVEC培养基
MEM	Gibco	11095114	10T1/2培养基
DMEM	Gibco	11965118	NHLF培养基
组织培养级PBS	Gibco	14190-144	无镁和钙
Accutase	Life Technologies	A1110501	用于消化HUVEC
胰蛋白酶	Life Technologies	15050065	用于消化10T1/2和NHLF
HUVEC	Lonza	C2517A
10T1/2	ATCC
NHLF	ATCC
Cytodex 3微载体珠	Sigma	C3275
组织培养包被的6 cm和10 cm培养皿	Corning
牛血浆纤维蛋白原	Sigma	F8630
凝血酶	Sigma	t9549
抑肽酶	Sigma	a3428
Falcon圆底管	Corning
组织培养孵箱和生物安全柜
24孔玻璃底板	MatTek	P24G1.513F	仅当需要对出芽结构进行成像时才需使用玻璃底板；否则，普通组织培养级塑料板也可接受。