来源：Brito-Sierra, C. A.，等。检测新型杀虫化学物质对蚊虫毒性的实验方案，《视觉化实验杂志》（2019年）
在本视频中，我们介绍了一种幼虫接触实验方法，用于评估多巴胺受体拮抗剂阿米替林对多种人类传染病已知传播媒介——蚊子三龄幼虫的毒性作用。通过在不同时间间隔下，将幼虫与不同浓度的阿米替林共同孵育，观察其死亡率，从而确定阿米替林的半数致死浓度（LC50）。
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方法文章
幼虫接触实验：一种通过直接接触测试杀幼虫化合物评估蚊虫幼虫死亡率的操作流程
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 幼虫接触实验（单点剂量或剂量反应实验）
注意： 该检测可使用溶于水或二甲基亚砜（DMSO）的化合物进行，前提是测试孔中DMSO的终浓度不超过1%。其他溶剂也可考虑，但必须首先确认其终浓度在暴露72小时后不会导致超过10%的死亡率。该检测可作为单点剂量检测或剂量-反应检测进行。若进行后者，建议测试一系列浓度（至少五个），覆盖预期的LC50范围。
- 标记一个透明的24孔组织培养板的各孔。
- 在1.5 mL离心管中配制待测化学品的储备液。
- 使用分析天平称取每种化学品，根据其溶解性特征，用无菌ddH2O、DMSO或其它合适的有机溶剂重新悬浮。
注意：计算时应考虑化学品的纯度。例如，对于纯度为99%的化学品，将10.1 mg溶解于1,000 μL丙酮中可得到1%的溶液。用封口膜密封后于-20 °C保存。
- 使用分析天平称取每种化学品，根据其溶解性特征，用无菌ddH2O、DMSO或其它合适的有机溶剂重新悬浮。
- 确定将要评估的待测化学品的终浓度，并使用适当的溶剂从储备液中进行相应的系列稀释。
注意：化学品和溶剂的浓度与体积可通过公式C1×V1=C2×V2计算，其中C1为样品1的浓度，C2为样品2的浓度，V1为样品1的体积，V2为样品2的体积。- 配制10 mM的储备液，并根据需要进行系列稀释以获得所需的测试浓度（表1B）。
- 使用宽口塑料移液管将五条L3期幼虫转移至组织培养测试板的孔中；L3期幼虫可通过其长度（约2.5–3.5 mm）和头壳宽度（约0.025 mm）进行识别。用1 mL移液器轻轻吸除孔中水分，并替换为所需体积的ddH2O。重复操作以获得每个处理组n = 4个技术重复（即每个处理组共20条幼虫）。
- 向24孔测试板中的四个重复孔分别加入适量的待测化学品，轻轻摇动培养板以确保化学品均匀混合。将培养板置于恒定环境条件下的试验或培养箱中（建议条件为25 °C，相对湿度约75–85%，若可能，采用12小时光照/12小时黑暗循环）。
注意：为保证实验间可重复性，后续实验应在相同的环境条件下进行。 - 在暴露后30分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、24小时、48小时和72小时（或其它设定时间点）记录每孔中死亡/无反应幼虫的数量，并填写在记录表上（表2）。轻轻敲击培养板侧壁，若未观察到运动，再用无菌牙签轻触幼虫。对无反应于敲击或触碰的幼虫记为“死亡”。
注意：可同时观察并记录其他形态学和行为学表型。 - 如需校正对照组死亡率，可使用修正的Abbott公式进行计算：
死亡率（%）= (X - Y) × 100 / (100 - Y)，
其中X为处理组的死亡率百分比，Y为对照组的死亡率百分比。 - 使用GraphPad Prism 6或类似软件将结果绘制成直方图或对数曲线，并相对于对照组计算致死浓度（LC）值。
- 使用另一批蚊虫重复实验，以获得n = 3或更多的生物学重复。
表1. 埃及伊蚊（Aedes aegypti）三龄幼虫（A）单剂量点实验和（B）剂量-反应实验的示例计算。
| A. 三种化学物质的单点剂量实验 | |||||
| 化学物质 | 浓度（400 μM） | ||||
| 阿米替林（Amitriptyline） | 80 mM 储备液：2 mg 阿米替林 × 98%（粉末纯度）× 0.001 g/1 mg × 1 mol /313.86 g × 1 L/0.08 mol × 106 μL/L = 78.06 μL 水。 | ||||
| 系列稀释：用 ddH2O 将储备液按 1:2 稀释，再按 1:4 稀释，得到 10 mM 溶液。取 40 µL 的 10 mM 储备液加入含有 960 µL ddH2O 的孔中，使终浓度为 400 µM/孔。将 10 mM 储备液按 1:2 进行系列稀释，制备 5 mM、2.5 mM、1.25 mM 和 0.625 mM 的储备液。 | |||||
| 顺式-(Z)-氟哌噻醇（cis-(z)-flupenthixol） | 80 mM 储备液：2 mg 顺式-(Z)-氟哌噻醇 × 98%（粉末纯度）× 0.001 g/1 mg × 1 mol/507.44 g 顺式-(Z)-氟哌噻醇 × 1 L/0.08 mol × 106 μL/L = 48.28 μL 水。 | ||||
| 系列稀释：同上。 | |||||
| 阿米特拉兹（Amitraz） | 80 mM 储备液：2 mg 阿米特拉兹 × 0.001 g/1 mg × 1 mol/293.4 g 阿米特拉兹 × 1 L/0.08 mol × 106 μL/1 L = 85.21 μL DMSO（注意：阿米特拉兹仅溶于 DMSO）。 | ||||
| 系列稀释：同上。 | |||||
| B. 剂量-反应实验 | |||||
| 化学物质 | 剂量 1 | 剂量 2 | 剂量 3 | 剂量 4 | 剂量 5 |
| 400 μM | 200 μM | 100 μM | 50 μM | 25 μM | |
| 例如：阿米替林、顺式-(Z)-氟哌噻醇或阿米特拉兹 | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL |
| 10 mM 储备液 | 5 mM 储备液 | 2.5 mM 储备液 | 1.25 mM 储备液 | 0.625 mM 储备液 | |
表2. 用于记录蚊子幼虫剂量-反应实验数据的示例评分表。 对照组为仅含水，或含1%二甲基亚砜（DMSO）或其他溶剂的水。测试小分子拮抗剂类化合物（如阿米替林）时常用的剂量为25 μM、50 μM、100 μM、200 μM和400 μM。
| 蚊子三龄幼虫检测 | ||||||
| 开始日期： | ||||||
| 研究人员： | ||||||
| 物种/品系： | ||||||
| 检测类型：单点剂量/剂量反应 | ||||||
| ||||||
| 时间（小时） | 剂量1 | 剂量2 | 剂量3 | 剂量4 | 剂量5 | 对照组 |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| 3 | ||||||
| 12 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| ||||||
| 时间（小时） | 剂量1 | 剂量2 | 剂量3 | 剂量4 | 剂量5 | 对照组 |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| 3 | ||||||
| 12 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 对杀虫剂敏感的蚊株 | 疟疾研究与试剂参考库 | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx；推荐 蚊株：埃及伊蚊利物浦（LVP）株、冈比亚按蚊 基苏木（KISUMU1）株和致倦库蚊约翰内斯堡（JHB）株 | |
| 丙酮 | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | 用于稀释和对照 |
| 双甲脒 | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | 需用DMSO稀释 |
| 阿米替林 | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | 可用丙酮稀释 |
| 顺式-(Z)-氟哌噻吨 | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | 经药理学验证可干扰dop样受体 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | 用于溶解双甲脒的有机溶剂 |
| 24孔带盖细胞培养板 | Corning Incorporated | 3526 | |
| 移液管 | Fisher Scientific | 13-711-7M | 用于幼虫分选 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZ6045 | 用于幼虫实验评分和显微操作 |
