局部施用测试实验：通过局部施用评估多巴胺受体拮抗剂对成年雌性蚊虫杀虫潜力的技术方法

摘要

来源：Brito-Sierra, C.A. 等，蚊虫新型杀虫化合物毒性检测方案。J. Vis. Exp. (2019)。

在本视频中，我们演示了通过点滴法检测潜在杀虫剂对成年雌性蚊虫的毒性。该方法利用一种多巴胺受体拮抗剂，该拮抗剂可导致蚊虫神经传递发生致死性抑制，从而评估杀虫剂经体表施用后的毒理效应。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核

1. 蚊虫成虫的培养

注意：疟疾研究与试剂参考库可提供对杀虫剂敏感的蚊子品系。推荐品系如下：Aedes aegypti 利物浦（LVP）品系、Anopheles gambiae 基苏木（KISUMU1）品系和 Culex quinquefasciatus 约翰内斯堡（JHB）品系。

1. 按照 Nuss 所述方法，在 28 °C 和 75–85% 相对湿度（RH）条件下，将蚊子幼虫卵置于 25 cm × 40 cm 的塑料托盘中培养，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗（每托盘约 400 条幼虫）。用研磨的沙鼠饲料喂养埃及伊蚊（A. aegypti 和 An. gambiae）幼虫，或用薄片状鱼饲料喂养致倦库蚊（C. quinquefasciatus）。进行幼虫实验时，采集处于三龄幼虫（L3）阶段的幼虫。
2. 将蛹转移至塑料杯中，在上述相同条件下，于昆虫饲养室内的 20 L 塑料笼中培育成成蚊。按其他文献所述方法，以 20% 蔗糖溶液维持成蚊生长。在羽化后 3–5 天收集成蚊。

结果

图 1：成蚊的培养。 图像显示用于培养成蚊的 20 L 塑料桶，以及使用吸蚊器移除蚊虫的过程。

图 2. 使用 4–5 日龄雌性 Aedes aegypti.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
对杀虫剂敏感的蚊株	疟疾研究与试剂参考库	https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; 推荐菌株：埃及伊蚊利物浦（LVP）菌株、冈比亚按蚊Kisumu（KISUMU1）菌株和致倦库蚊约翰内斯堡（JHB）菌株
丙酮	Mallinckrodt Chemical	CAS 67-64-1	用于稀释和对照
阿米替林	Sigma-Aldrich	CAS: 549-18-8	可用丙酮稀释
联苯菊酯	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	用作阳性对照的合成拟除虫菊酯
微量点样器	Burkard Manufacturing Co.	-	进行局部施用实验所需的工具
带盖24孔细胞培养板	Corning Incorporated	3526	-
Advantage 橡皮筋	Alliance Rubber Co.	-	用于密封纸杯
玻璃注射器（1 ml）	Becton Dickinson and Co.	512004	微量施用所需。玻璃优于塑料
一次性闪烁小瓶（20 ml）	Fisher Scientific	74505-20	玻璃小瓶可防止蒸发
白纱布	沃尔玛	-	-
纸杯	Dixie Consumer Products LLC.	PF15675/13D	用于成年蚊子局部实验中饲养成蚊
培养皿（150 mm）	Corning Life Sciences	-	用于在不直接接触冰块的情况下，低温维持蚊子处于"睡眠"状态
移液管	Fisher Scientific	13-711-7M	用于分选幼虫
体视显微镜	Olympus	SZ6045	用于观察幼虫实验结果和进行微量施用
镊子（精细）	Fontax	-	用于处理成年蚊子