局部测试试验:一种通过局部应用评估多巴胺受体拮抗剂对成年雌性蚊子的杀虫潜力的技术

摘要

来源:Brito-Sierra， C.A. et al.， 测试新型杀虫剂化学对蚊子的毒性的方案。 （2019 年）。

在本视频中，我们演示了局部检测分析，以确定潜在杀虫剂对成年雌性蚊子的毒性。该方法使用对蚊子神经传递造成致命抑制的多巴胺受体拮抗剂，描述了一种评估杀虫剂在局部应用时的毒性作用的方法。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查

1. 蚊子成虫的培养

注意:疟疾研究和试剂参考存储库中提供了对杀虫剂敏感的蚊子菌株。推荐的菌株如下:埃及伊蚊利物浦 （LVP） 菌株、冈比亚按蚊基苏木 （KISUMU1） 菌株和约翰内斯堡库蚊 （JHB） 菌株。

1. 如Nuss所述，在28°C和75-85%相对湿度（RH）下，在25 cm x 40 cm塑料托盘（每个托盘~400只幼虫）中以12小时昼夜周期从卵中培养蚊子幼虫。喂幼虫磨沙鼠 （A. aegypti 和 An. gambiae） 或鱼片食物 （C. quinquefasciatus）。对于幼虫测定，在第三个幼虫 （L3） 龄阶段收集幼虫。
在
2. 上述条件下，将蛹的后部成蚊转移到塑料杯中，并放置在昆虫室的 20 L 塑料笼内。按照其他地方的说明，将蚊子保持在 20% 的糖溶液上。在出苗后 3-5 天收集成虫。

2. 成人局部测定（单点剂量或剂量反应测定）

注意:成人局部测定是使用丙酮作为溶剂进行的。替代溶剂可能是一种选择，但必须首先确认最终浓度在暴露后 48 小时不会导致超过 10% 的死亡率。该测定可以作为单点剂量或剂量反应测定进行，用于确定致死剂量 （LD）。如果执行后者，建议测试一系列浓度（至少 5），跨越预期的 LD₅₀。

1. 确定完成检测所需的成年雌性蚊子的数量。
   注意:使用单一化学试剂的点剂量测定至少需要 90 只蚊子（阳性对照 30 只，仅丙酮阴性对照 30 只，测试化学 30 只）。
2. 培养 3 至 5 日龄的成年雌性蚊子，并使用抽吸器移至单独的 20 mL 塑料桶中（图 1）。
3. 在 9 盎司纸杯上贴上测试化学成分的名称和浓度标签。为每个杯子留出 10 厘米 x 10 厘米的网眼方块和橡皮筋（见图 2）。
4. 选择现有的杀虫剂作为阳性对照（例如，合成拟除虫菊酯、联苯菊酯），并在丙酮中制备 1% 储备溶液 （10 μg/μL><）。 注意:计算应考虑化学成分的纯度。例如，对于纯度为 99% 的填料，将 10.1 mg 溶解在 1,000 μL 丙酮中，以获得 1% 的溶液。用石蜡膜密封并储存在 -20 °C。
5. 使用与上述相同的步骤，制备测试化学试剂的储备液。
   注意:许多测试化学成分非常不稳定，每次进行生物测定时，最好将溶液新鲜制备。
6. 如图 3 所示，使用之前用丙酮冲洗的 20 mL 玻璃样品瓶，从储备液中制备阳性对照和测试化学试剂的梯度稀释液。
7. 用丙酮灌注 1 mL 玻璃注射器，填充丙酮，并固定在调节后的微量涂抹器中，以提供 0.25 μL 的体积。
以
8. 10 只为一组，使用抽吸器从笼子中取出 3 - 5 天大的成年雌性蚊子，并在 4 °C 下在冰箱或冰上麻醉长达 5 分钟。接下来，将蚊子转移到培养皿中，放在冰上最多 10 分钟。
9. 快速工作，用细镊子取出一只雌性，然后使用注射器微量涂抹器将 0.25 μL 测试溶液涂抹在背侧胸部。通过使用解剖显微镜观察来确认化学试剂的递送，以确保每只蚊子都接受适当体积的化学试剂。
10. 将蚊子转移到放在冰上的贴有标签的纸杯中，重复 9 次以获得 n = 10 只处理过的蚊子。用橡皮筋固定的网眼方块将蚊子密封在杯子中，并在 28 °C 和 75-85% RH 的恒定条件下转移到塑料桶或生长室中（最好在 12 小时白天/12 小时夜间循环）。
11. 重复上述实验两次，以获得每个治疗组或对照组的 n = 3 个技术重复（即总共 30 只蚊子）。
12. 首先对测试化学试剂重复步骤 2.7 - 2.10，然后对阳性对照重复。
    注意:如果有足够的蚊子可用，另一个有用的控制措施是 30 只麻醉蚊子的"空白"，这些蚊子既没有接受测试化学试剂，也没有接受溶剂。
13. 使用评分表记录暴露后 30 分钟、60 分钟、2、24 和 48 小时（或其他时间点）的"死亡/无反应"蚊子的数量（表 1）。如果蚊子表现出缺乏运动，则将其评分为 "死亡/无反应"，定义为单侧或仰卧并且无法飞行。
14. 如果需要，使用修改后的 Abbott 公式校正控制死亡率，如下所示:
    死亡率 （%） = （X-Y） *100/（100-Y），
    其中 X = 处理样品中的死亡率百分比，Y = 对照中的死亡率百分比。
15. 将结果显示为直方图或指数曲线。对于剂量反应测定，计算测试化学相对于对照的 LD₅₀、LD₇₅ 或 LD₉₀ 值。
16. 使用不同批次的蚊子重复测定至少两次，以获得 n = 3 或更多生物重复。

结果

图 1:成年蚊子的培养。图像显示 20 L 塑料桶用于培养成年蚊子并使用抽吸器清除蚊子。

图 2.使用 4-5 日龄雌性埃及伊蚊进行的成人局部测定。 用化学试剂或溶剂处理后，将成年蚊子放入纸杯中，并在检测期间转移到测试室中。

材料