局部施用测试实验：通过局部施用评估多巴胺受体拮抗剂对成年雌性蚊虫杀虫潜力的技术方法

摘要

来源：Brito-Sierra, C.A. 等，蚊虫新型杀虫化合物毒性检测方案。J. Vis. Exp. (2019)。

在本视频中，我们演示了通过点滴法检测潜在杀虫剂对成年雌性蚊虫的毒性。该方法利用一种多巴胺受体拮抗剂，该拮抗剂可导致蚊虫神经传递发生致死性抑制，从而评估杀虫剂经体表施用后的毒理效应。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核

1. 蚊虫成虫的培养

注意：疟疾研究与试剂参考库可提供对杀虫剂敏感的蚊子品系。推荐品系如下：Aedes aegypti 利物浦（LVP）品系、Anopheles gambiae 基苏木（KISUMU1）品系和 Culex quinquefasciatus 约翰内斯堡（JHB）品系。

1. 按照 Nuss 所述方法，在 28 °C 和 75–85% 相对湿度（RH）条件下，将蚊子幼虫卵置于 25 cm × 40 cm 的塑料托盘中培养，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗（每托盘约 400 条幼虫）。用研磨的沙鼠饲料喂养埃及伊蚊（A. aegypti 和 An. gambiae）幼虫，或用薄片状鱼饲料喂养致倦库蚊（C. quinquefasciatus）。进行幼虫实验时，采集处于三龄幼虫（L3）阶段的幼虫。
2. 将蛹转移至塑料杯中，在上述相同条件下，于昆虫饲养室内的 20 L 塑料笼中培育成成蚊。按其他文献所述方法，以 20% 蔗糖溶液维持成蚊生长。在羽化后 3–5 天收集成蚊。

2. 成虫外用试验（单点剂量或剂量反应试验）

注意： 成虫外用实验采用丙酮作为溶剂。也可选用其他溶剂，但必须首先确认最终浓度在暴露后48小时导致的死亡率不超过10%。该实验可作为单剂量点或剂量-反应实验进行，用于测定致死剂量（LD）。若进行后者，建议测试一系列浓度（至少五个），覆盖预期的LD₅₀范围。

1. 确定完成该检测所需的成年雌性蚊虫数量。
   注意：使用单一化学物质进行单剂量检测时，至少需要90只蚊虫（30只用于阳性对照，30只用于仅含丙酮的阴性对照，30只用于测试化学物）。
2. 培养3至5日龄的成年雌性蚊虫，并使用吸虫器将其转移至单独的20 mL塑料杯中（图1）。
3. 用测试化学物的名称和浓度标记9盎司纸杯，并为每个纸杯准备10 cm × 10 cm的纱网片和橡皮筋（见图2）。
4. 选择一种现有杀虫剂作为阳性对照（例如，合成拟除虫菊酯类杀虫剂联苯菊酯），用丙酮配制1%的储备液（10 µg/µL）。
   注意：计算时应考虑化学物的纯度。例如，对于纯度为99%的化学物，将10.1 mg溶解于1,000 µL丙酮中，即可获得1%溶液。用石蜡膜密封后，于-20 °C保存。
5. 采用与上述相同的方法，配制测试化学物的储备液。
   注意：许多测试化学物极不稳定，建议每次进行生物测定前新鲜配制溶液。
6. 使用先前用丙酮冲洗过的20 mL玻璃小瓶，从储备液中按图3所示方法对阳性对照和测试化学物进行系列稀释。
7. 用丙酮冲洗1 mL玻璃微量注射器，再用丙酮充满，并将其固定在微量施用装置上，调整至递送体积为0.25 µL。
8. 以每批10只为一组，使用吸虫器从笼中取出3–5日龄的成年雌性蚊虫，在冰箱或冰上于4 °C下麻醉最多5分钟。随后将蚊虫转移至培养皿中，并置于冰上最多10分钟。
9. 迅速用精细镊子夹取一只雌蚊，使用微量注射器将0.25 µL测试溶液施加于其背部胸节。通过解剖显微镜观察确认化学物的递送，确保每只蚊虫均接受准确体积的测试化学物。
10. 将处理后的蚊虫转移至置于冰上的已标记纸杯中，重复操作共10次，以获得n = 10只处理蚊虫。用纱网片覆盖杯口并用橡皮筋固定，密封后将纸杯转移至塑料容器或恒温恒湿培养箱中，在28 °C、75–85%相对湿度条件下培养（建议采用12小时光照/12小时黑暗循环）。
11. 重复上述实验两次，以获得每个处理组或对照组n = 3个技术重复（即，共30只蚊虫）。
12. 依次对测试化学物和阳性对照重复步骤2.7–2.10。
    注意：若蚊虫数量充足，另一个有用的对照是设置一组“空白”对照，包含30只经麻醉但未施加测试化学物或溶剂的蚊虫。
13. 使用评分表（表1）记录暴露后30分钟、60分钟、2小时、24小时和48小时（或其他时间点）“死亡/无反应”蚊虫的数量。若蚊虫无活动能力，表现为侧卧或仰卧且无法飞行，则记为“死亡/无反应”。
14. 如需校正对照组死亡率，可采用修正的Abbott公式计算：
    死亡率（%）= (X - Y) × 100 / (100 - Y)，
    其中X = 处理组的死亡率百分比，Y = 对照组的死亡率百分比。
15. 以直方图或指数曲线形式展示结果。对于剂量-反应测定，计算测试化学物相对于对照的LD₅₀、LD₇₅或LD₉₀值。
16. 至少使用不同批次的蚊虫重复该检测两次，以获得n = 3或更多的生物学重复。

结果

图 1：成蚊的培养。 图像显示用于培养成蚊的 20 L 塑料桶，以及使用吸蚊器移除蚊虫的过程。

图 2. 使用 4–5 日龄雌性 Aedes aegypti...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
对杀虫剂敏感的蚊株	疟疾研究与试剂参考库	https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; 推荐菌株：埃及伊蚊利物浦（LVP）菌株、冈比亚按蚊Kisumu（KISUMU1）菌株和致倦库蚊约翰内斯堡（JHB）菌株
丙酮	Mallinckrodt Chemical	CAS 67-64-1	用于稀释和对照
阿米替林	Sigma-Aldrich	CAS: 549-18-8	可用丙酮稀释
联苯菊酯	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	用作阳性对照的合成拟除虫菊酯
微量点样器	Burkard Manufacturing Co.	-	进行局部施用实验所需的工具
带盖24孔细胞培养板	Corning Incorporated	3526	-
Advantage 橡皮筋	Alliance Rubber Co.	-	用于密封纸杯
玻璃注射器（1 ml）	Becton Dickinson and Co.	512004	微量施用所需。玻璃优于塑料
一次性闪烁小瓶（20 ml）	Fisher Scientific	74505-20	玻璃小瓶可防止蒸发
白纱布	沃尔玛	-	-
纸杯	Dixie Consumer Products LLC.	PF15675/13D	用于成年蚊子局部实验中饲养成蚊
培养皿（150 mm）	Corning Life Sciences	-	用于在不直接接触冰块的情况下，低温维持蚊子处于"睡眠"状态
移液管	Fisher Scientific	13-711-7M	用于分选幼虫
体视显微镜	Olympus	SZ6045	用于观察幼虫实验结果和进行微量施用
镊子（精细）	Fontax	-	用于处理成年蚊子