蚊媒喂食实验：一种评估测试化合物对成年雌性蚊虫死亡率和繁殖力影响的方法

摘要

来源：Brito-Sierra, C. A. 等，蚊虫新型杀虫化合物毒性检测方案。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种通过血液饲喂来评估具有新型作用机制的测试化合物对雌性蚊虫致死率和生殖力影响的实验方法。该技术有助于筛选新型杀虫剂，以杀灭抗药性蚊虫种群并控制疾病传播。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 成虫吸血实验（单剂量或剂量反应实验）

1. 收集约150只4至5日龄的成年雌性蚊虫，转移至单独的笼子中。若进行剂量-反应实验，重复此步骤共获得6个笼子。在喂食实验前1至24小时移除糖源。
2. 按照上述方法配制化合物的储备液，需根据化合物的纯度进行计算（典型的储备液浓度为80 mM，溶于水或盐缓冲液中），然后根据需要用水或缓冲液进行系列稀释。
3. 将每种稀释液各取 40 µL 加入 960 µL 去纤维蛋白兔血中，以获得所需的测试浓度。将膜片覆盖于喂食单元上，并用橡胶圈密封。转移 1 mL 血液 通过 移液管，并将喂养装置连接至加热装置。
4. 用新鲜配制的10%乳酸溶液轻轻擦拭膜表面，将饲喂装置放入成蚊笼中。用深色布或黑色垃圾袋覆盖笼子，让蚊子饲喂一小时。
5. 对剩余的测试溶液和阴性（仅血液）对照重复步骤 1.2 至 1.4。
6. 喂食完成后，将容器置于4 °C冰箱中5分钟，以麻醉蚊虫。移除雄性蚊虫及未吸血的雌性蚊虫，通过观察腹部情况，计数并记录吸血完全和部分吸血的雌蚊总数。
7. 保留部分吸血和完全吸血的雌蚊，每剂量至少保留50只吸血雌蚊。
8. 将桶转移至塑料箱或培养室中，在28 °C和75–85%相对湿度的恒定条件下培养（建议采用12小时光照/12小时黑暗的循环周期）。
9. 使用计分表记录0.5、1、1.5、2、24、48和72小时（或根据需要选择其他时间点）死亡/无反应蚊虫的总数表1).
10. 在吸血后的第三天，将一个产卵杯放入笼中，收集72小时内的卵。在解剖显微镜下计数每种处理条件下产生的卵的总数。
11. 根据每个处理组和对照组中已摄食蚊虫的总数，计算死亡率百分比和生殖力。如有需要，可使用修正的阿博特公式对对照组死亡率进行校正。
12. 使用选定的软件将毒性与繁殖力数据以直方图或指数曲线（如进行剂量-反应实验）形式展示。若进行剂量-反应实验，计算LD₅₀，LD₇₅，或LD₉₀ 相对于对照组的检测化学值。
13. 使用不同批次的蚊虫至少重复实验两次，以获得 n = 3 或更多的生物学重复。

表1. 用于记录成年蚊虫吸血实验数据的示例评分表。 测试小分子拮抗剂化合物（如阿米替林）的典型剂量为 50 µM、100 µM、200 µM 和 400 µM。

蚊虫成虫（3-5日龄）表面施用实验
实验开始日期：
研究人员：
物种/品系：
实验类型：单点剂量/剂量-反应
A. 死亡数（死亡蚊虫数量）
时间（小时）	剂量1	剂量2	剂量3	剂量4	剂量5	对照组
0.5
1
1.5
2
2.5
B. 死亡率（百分比）
时间（小时）	剂量1	剂量2	剂量3	剂量4	剂量5	对照组
0.5
1
1.5
2
2.5

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
对杀虫剂敏感的蚊株	疟疾研究与试剂资源库	https://www.beiresources.org/ MR4Home.aspx；推荐菌株：埃及伊蚊利物浦（LVP）菌株、冈比亚按蚊科苏木（KISUMU1）菌株和致倦库蚊约翰内斯堡（JHB）菌株
联苯菊酯	Sigma-Aldrich	CAS: 51529-01-2	用作阳性对照的合成拟除虫菊酯
去纤维兔血	Hemostat	DRB0100	适应人工饲喂蚊虫的血液来源
Hemotek膜饲系统	Hemotek Ltd	序列号 1303	用于蚊虫饲喂
移液管	Fisher Scientific	13-711-7M U
体视显微镜	Olympus	SZ6045	用于幼虫实验评分和微量施加操作
镊子（精细）	Fontax		用于处理成蚊
纸杯	Dixie Consumer Products LLC.	PF15675/13D	用于成蚊经皮实验中饲养成蚊
Advantage橡胶圈	Alliance Rubber Co.		用于密封纸杯