蛋白质聚集体形成测定:一种在蛋白酶体抑制剂诱导下检测和定量培养细胞中蛋白质聚集的方法

摘要

来源:Lee， H. et al.活细胞中 Sod1 突变蛋白聚集体形成的高内涵定量分析开发。J. Vis. Exp.（2017 年）

在本视频中，我们演示了一种使用蛋白酶体抑制剂的基于细胞的蛋白质聚集测定，该抑制剂阻断蛋白酶体活性，防止与荧光标记融合的错误折叠突变蛋白进行泛素依赖性蛋白酶体降解，导致它们在细胞质内积累。然后通过荧光显微镜观察和定量蛋白质聚集体。

方案

1. 慢病毒生产

注意:慢病毒载体的生产和作是根据美国国立卫生研究院 （NIH） 涉及重组 DNA 的研究指南进行的。使用编码野生型和A4V突变体SOD1的质粒，这些质粒被增强型YFP（SOD1WT-YFP和SOD1A4V-YFP）标记。使用 PCR 引物对 5'-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3' 和 5'-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3' 扩增两种基因融合产物，并使用 XhoI 和 BsrGI 限制性位点插入 pTRIP-delta U3 CMV 质粒中。避免超过 20 次传代并将细胞维持在低于 60% 的汇合度有助于确保良好的转染效率。

1. 第 1 天，在 10 mL 细胞培养基（含 10% FBS 和 4 mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖 DMEM）中，在 10 cm 直径的组织培养板（3 x 10⁶ 个细胞/皿）中以 30 - 40% 汇合度分流 HEK-293T 细胞，用于病毒生产。
2. 将直径为 10 cm 的组织培养板保存在 CO₂ 培养箱（37 °C，5% CO₂）中过夜。
3. 第 2 天，准备含有 10 μg 慢病毒载体（pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP 或 -SOD1A4V-YFP）以及慢病毒包装质粒（5 μg pVSVg;10 μg pCMV-dR8.71）的 DNA 转染溶液（图 1A）。加入 125 μL 1 M CaCl₂，并使用蒸馏水将体积调节至 500 μL。向混合物中轻轻加入 500 μL 0.05 M HEPES，并在室温下孵育 10 分钟。
4. 用 10 mL 预热的无抗生素新鲜培养基和 1 mL DNA 转染溶液混合替换 HEK-293T 细胞培养基，并在 37 °C、5% CO₂ 下孵育过夜。
5. 第 3 天，用新鲜培养基替换细胞上清液。
6. 第 4 天，在 15 mL 试管中收获上清液，并以 500 x g 离心 5 分钟以去除死细胞和碎片。使用 60 mL 大注射器将上清液通过 0.45 μm 过滤器，进一步纯化上清液。立即分装成一次性等分试样 （300 μL），并储存在 -80 °C 下。为了保持最大的产品活性，请避免冻融循环。

2. 慢病毒转导

在
1. 6 孔组织培养板中，在 2 mL 补充有 10% FBS 的 DMEM 培养基中，以 60% 汇合度（HEK-293 细胞和 SH-SY5Y;每孔 5 x 10⁵ 个细胞和 U2OS;每孔 1 x 10⁵ 个细胞）分流要感染的细胞系。
2. 将 6 孔组织培养板置于 37 °C 培养箱中，以 5% CO₂ 放置过夜。
3. 从 -80 °C 冰箱中取出冷冻慢病毒，每次使用前在冰上解冻等分试样;不要重新冷冻。
4. 当病毒解冻时，加热含有与目标细胞系相容的血清的细胞培养基。病毒完全解冻后，在新鲜的 1.5 mL 微量离心管中，在 DMEM 中制备一系列稀释液（1:3、1:10、1:30 和 1:100）。
5. 用减少的血清培养基将试管中的体积增加到 1 mL。
6. 向 1 mL 病毒/培养基中加入 2 μL 聚凝胺（储备液为 4 μg/μL）。通过移液充分混合，并向细胞中加入 1 mL 混合物。将细胞与病毒一起孵育 24 小时。
7. 去除病毒培养基，并更换为补充有 10% FBS 的普通 DMEM 培养基。将细胞维持在 37 °C，5% CO₂ 下。
8. 监测细胞的生长并每两天更换一次培养基。汇合时，将 6 孔培养皿扩展至直径为 10 cm 的组织培养板中。
9. 细胞充分扩增后，在 384 孔检测板上的 50 μL DMEM 培养基中每孔接种 1.5 x 10⁴ 个细胞，以通过显微镜检查 YFP 标记蛋白的表达水平。如果 YFP 标记的蛋白细胞表达显示信噪比 ≥3，则为相应的细胞系准备细胞储备液。

3. 蛋白酶体抑制剂对蛋白质聚集的时间依赖性影响

注意:使用自动显微镜进行图像采集（参见材料）。

1. 在 384 孔平底板上分配 0.25 μL 溶解在 100% DMSO （ALLN， 2 mM） 中的 DMSO 或蛋白酶体抑制剂。
在同一
2. 检测板上的 50 μL DMEM 培养基中手动接种每孔 1.5 x 10⁴ 个细胞。蛋白酶体抑制剂 （ALLN） 终浓度应为 10 μM。
3. 将显微镜系统环境控制单元设置为 37 °C 和 5% CO₂。实验装置的屏幕截图如图 2 所示。
4. 使用具有以下设置的软件，在宽视场荧光模式下作显微镜:LWD 20X 物镜，非共聚焦模式，4 个视野/孔，捕获间隔为一小时。在每次运行结束时，捕获的图像会自动上传到服务器。

4. 活细胞中 YFP 表达的延时成像和图像分析（单通道）

注意:以下步骤描述了软件的应用（例如，Columbus）。

1. 选择适当的算法来分割主要对象（胞质溶胶和聚集体）。如果需要，调整背景阈值和对比度参数（图 3）。
2. 使用 'find cells' 对细胞进行计数，YFP 强度通道的单个阈值为 0.1。使用相对 YFP 点强度 >0.2 且分裂系数为 1.0 的"查找点"算法确定聚集体。

5. 蛋白酶体抑制剂对细胞核染色（两个通道）上蛋白质聚集的剂量反应效应

注意:使用自动显微镜进行图像采集。根据预期的 IC50 值确定蛋白酶体抑制剂（ALLN、Epoxomicin 和 MG132）的浓度范围，以确保最佳曲线拟合。

1. 通过标准 1:3 稀释系列在 384 孔储存聚丙烯板上制备化合物的连续稀释液。确保化合物稀释液充分混合，以确保化合物浓度准确。
2. 将 0.25 μL 蛋白酶体抑制剂分装在空的平底黑色 384 孔检测板上。我们使用配备能够转移体积的 384 毛细管头的液体处理器。
3. 在检测板上的 50 μL DMEM 培养基中每孔接种 1.5 x 1010⁴ 个细胞。将检测板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 24 小时。
4. 加入 10 μL DMEM 培养基（在 37 °C 下预热）和染色溶液（Hoechst 33342，原液为 10 mg/mL），并在室温下孵育 10 分钟。
5. 启动显微镜作软件。实验设置的屏幕截图如图 4 所示。选择 "Configuration" 选项卡，然后选择 20X 物镜和正确的板类型。确保在物镜上将 "collar" 设置为正确的值，以便对不同类型的板进行正确聚焦。
6. 选择 "显微镜" 选项卡。将曝光 1 定义为 YFP（488 激光），将曝光 2 定义为 Hoechst（405 激光）。激活两种曝光的滤镜，并将曝光 1 分配给相机 1，将曝光 2 分配给相机 2。将曝光时间设置为 ~800 ms（曝光 1）和 ~40 ms（曝光 2）。
7. 选择 exposure 1（曝光度 1）。将焦点高度设置为 0 μm。选择 "Focus"。对焦后，曝光相机 1。调整焦距高度以优化曝光平面，然后单击"取高"。更改曝光时间和激光功率，以提供 ~3,000 的最大像素强度。保存曝光参数。对曝光 2 重复上述步骤。
8. 选择 "Experiment Definition" 选项卡。创建布局和子布局。拖放相关布局、曝光度、参考图像、skewcrop 文件和子布局。保存实验。
9. 选择 "Automatic Experiment" 选项卡并获取图像。在每次运行结束时，捕获的图像会自动上传到服务器。

6. 双通道图像的图像分析

1. 选择软件算法以分割主要对象（细胞核、胞质溶胶和聚集体）（图 5）。
2. 选择通过目视检查分割对象来准确分割细胞核的方法。通道 1 （Ch1） 中的 Hoechst 染色对象将用于确定细胞数。通道 2 （Ch2） 中突变体 SOD1-A4V 的 YFP 染色将用于确定聚集体的量。
3. 使用"查找细胞核"算法作为 Hoechst 染色区域 >20 μm²，分裂因子为 7.0，单个阈值为 0.40，对比度为 0.10>。
4. 创建数据表并使用绘图软件中的"非线性回归"方程确定每种化合物的 EC50。

结果

图 1.SOD1 WT 和 A4V 稳定线路生成。（A） 用于野生型和突变型 SOD1 A4V 慢病毒生成的慢病毒和包装载体（包装和包膜质粒）的示意图。（B） 用慢病毒野生型 SOD1 （WT） 和突变型 SOD1 （A4V） 转导的三个细胞 （HEK-293、U2OS 和 SH-SY5Y） 的选定共聚焦图像。（C） 用蛋白酶体抑制剂 ALLN （10μM） 处理 24 小时的三个稳定细胞的代表性图像。发现 SOD1A4V-YFP 聚集体在 HEK-293 中大量存在 （红色箭头），但在 U2OS 或 SH-SY5Y 细胞中稀疏存在。使用 20 倍物镜采集图像。比例尺 = 50 μm。

材料