蛋白质聚集体形成检测：一种在蛋白酶体抑制剂诱导下检测和定量培养细胞中蛋白质聚集的方法

摘要

来源：Lee, H. 等. 活细胞中 Sod1 突变蛋白聚集形成高内涵定量分析方法的建立。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们展示了一种基于细胞的蛋白质聚集检测方法，该方法使用蛋白酶体抑制剂来阻断蛋白酶体活性，从而阻止与荧光标签融合的错误折叠突变蛋白发生泛素依赖性的蛋白酶体降解，导致这些蛋白在细胞质中积累。随后通过荧光显微镜对蛋白质聚集体进行可视化和定量分析。

方案

1. 慢病毒的制备

注意：慢病毒载体的制备与操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）关于重组DNA研究的指导原则进行。使用编码与增强型黄色荧光蛋白（YFP）融合的野生型及A4V突变型SOD1的质粒（SOD1WT-YFP 和 SOD1A4V-YFP）。两种基因融合产物均通过PCR引物对5′-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3′ 和 5′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′进行扩增，并利用XhoI和BsrGI限制性酶切位点插入至pTRIP-delta U3 CMV质粒中。避免细胞传代超过20代，并将细胞维持在低于60%汇合度，有助于确保较高的转染效率。

1. 第1天，将HEK-293T细胞以30–40%汇合度接种于直径10 cm的组织培养皿中（每皿3 × 10⁶个细胞），加入10 mL细胞培养基（高糖DMEM，含10%胎牛血清和4 mM L-谷氨酰胺），用于病毒生产。
2. 将直径10 cm的组织培养皿置于CO₂培养箱中（37 °C，5% CO₂）过夜培养。
3. 第2天，配制DNA转染溶液：包含10 µg慢病毒载体（pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP 或 -SOD1A4V-YFP）以及慢病毒包装质粒（5 µg pVSVg；10 µg pCMV-dR8.71）（图1A）。加入125 µL 1 M CaCl₂，并用蒸馏水定容至500 µL。轻柔加入500 µL 0.05 M HEPES，混匀后室温孵育10分钟。
4. 将HEK-293T细胞的培养基更换为10 mL预热的新鲜无抗生素培养基，并与1 mL DNA转染溶液混合，于37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育。
5. 第3天，将细胞上清液更换为新鲜培养基。
6. 第4天，收集上清液至15 mL离心管中，以500 ×g离心5分钟，去除死细胞和碎片。使用60 mL大容量注射器将上清液经0.45 µm滤器进一步过滤纯化。立即分装为单次使用量（300 µL/管），于-80 °C保存。为保持产物最高活性，请避免反复冻融。

2. 慢病毒转导

1. 将待感染的细胞系（HEK-293细胞和SH-SY5Y细胞：每孔5 × 10⁵个细胞；U2OS细胞：每孔1 × 10⁵个细胞）以60%融合度接种于6孔组织培养板中，每孔加入2 mL含10% FBS的DMEM培养基。
2. 将6孔组织培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养。
3. 从-80 °C冰箱中取出冷冻的慢病毒，每次使用前在冰上解冻一份 aliquot；切勿再次冷冻。
4. 在病毒解冻的同时，将适用于目标细胞系的含血清细胞培养基预热。待病毒完全解冻后，在新的1.5 mL离心管中用DMEM制备一系列稀释梯度（1:3、1:10、1:30 和 1:100）。
5. 用低血清培养基将各管体积补至1 mL。
6. 向1 mL病毒/培养基混合液中加入2 µL Polybrene（储存浓度为4 µg/µL），通过移液充分混匀，然后将1 mL混合液加入细胞中。与病毒共同孵育24小时。
7. 移除含病毒的培养基，更换为含10% FBS的正常DMEM培养基，并在37 °C、5% CO₂条件下继续培养细胞。
8. 监测细胞生长情况，每两天更换一次培养基。当细胞达到融合状态时，将6孔板中的细胞扩增至直径10 cm的组织培养皿中。
9. 待细胞充分扩增后，将1.5 × 10⁴个细胞接种至384孔检测板的每孔中，每孔体积为50 µL DMEM培养基，通过显微镜检测YFP标记蛋白的表达水平。若YFP标记蛋白的细胞表达信噪比≥3，则为相应细胞系制备细胞储备液。

3. 蛋白酶体抑制剂对蛋白质聚集的时间依赖性效应

注意：使用自动显微镜进行图像采集（参见材料部分）。

1. 在384孔平底板上，每孔加入0.25 µL DMSO或溶于100% DMSO中的蛋白酶体抑制剂（ALLN，2 mM）。
2. 在相同的检测板上，每孔手动接种1.5 × 10⁴个细胞，加入50 µL DMEM培养基。蛋白酶体抑制剂（ALLN）的终浓度应为10 µM。
3. 将显微镜系统的环境控制单元设置为37 °C和5% CO₂。实验装置的截图见图2。
4. 以宽场荧光模式操作显微镜，使用软件设置如下：长工作距离20X物镜，非共聚焦模式，每孔拍摄4个视野，拍摄间隔为1小时。每次运行结束后，所采集的图像将自动上传至服务器。

4. 活细胞中YFP表达的延时成像及图像分析（单通道）

注意： 以下步骤描述了该软件的应用（例如，哥伦布）

1. 选择适当的算法来分割主要对象（胞质和聚集体）。如有需要，调整背景阈值和对比度参数（图3）。
2. 使用“寻找细胞”功能，对YFP荧光强度通道设置0.1的独立阈值来计数细胞。使用“寻找斑点”算法检测聚集体，设定相对YFP斑点强度>0.2，分裂系数为1.0。

5. 蛋白酶体抑制剂对活细胞中蛋白质聚集的剂量反应效应（细胞核染色，双通道）

注意：使用自动显微镜进行图像采集。根据预期的IC50值确定蛋白酶体抑制剂（ALLN、Epoxomicin和MG132）的浓度范围，以确保获得理想的曲线拟合。

1. 在384孔聚丙烯储存板上，使用标准的1:3系列稀释法配制化合物的梯度稀释液。确保充分混匀化合物稀释液，以保证化合物浓度准确。
2. 将0.25 µL蛋白酶体抑制剂分配至空的黑色平底384孔检测板中。我们使用配备可转移微小体积液体的384通道毛细管头的液体处理仪。
3. 在检测板的每孔中加入1.5 × 10⁴个细胞，悬浮于50 µL DMEM培养基中。将检测板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。
4. 向每孔加入10 µL预热至37 °C的DMEM培养基，其中含有染色液（Hoechst 33342，储存浓度为10 mg/mL），室温孵育10分钟。
5. 启动显微镜操作软件。图4展示了实验设置的截图。选择“Configuration”（配置）选项卡，选择20倍物镜和正确的板型。确保物镜上的“collar”（校正环）设置为对应板型的正确数值，以实现准确聚焦。
6. 选择“Microscope”（显微镜）选项卡。将曝光1设置为YFP（488激光），曝光2设置为Hoechst（405激光）。在两个曝光通道上均启用滤光片，并将曝光1分配给相机1，曝光2分配给相机2。将曝光时间分别设置为曝光1约800 ms，曝光2约40 ms。
7. 选择曝光1。将聚焦高度设为0 µm，点击“Focus”（聚焦）。聚焦完成后，启动相机1曝光。调节聚焦高度以优化曝光平面，点击“Take height”（获取高度）。调整曝光时间和激光功率，使最大像素强度约为3,000。保存曝光参数。对曝光2重复相同步骤。
8. 选择“Experiment Definition”（实验定义）选项卡。创建布局和子布局。拖放相关的布局、曝光设置、参考图像、skewcrop文件和子布局。保存实验设置。
9. 选择“Automatic Experiment”（自动实验）选项卡并开始采集图像。每次运行结束后，所捕获的图像将自动上传至服务器。

6. 双通道图像的图像分析

1. 选择用于分割主要对象（细胞核、细胞质和聚集体）的软件算法（图5）。
2. 通过目视检查分割结果，选择能够准确分割细胞核的方法。通道1（Ch1）中Hoechst染色的区域将用于确定细胞数量；通道2（Ch2）中突变型SOD1-A4V的YFP荧光信号将用于确定聚集体的含量。
3. 使用“寻找细胞核”算法进行细胞计数，设定Hoechst染色区域>20 µm²，分裂因子为7.0，个体化阈值为0.40，对比度>0.10。
4. 创建数据表格，并利用绘图软件中的“非线性回归”方程计算每种化合物的EC50值。

结果

图1. SOD1野生型和A4V突变型稳定细胞系的构建。（A）用于生成野生型和突变型SOD1 A4V慢病毒的慢病毒载体及包装载体（包装和包膜质粒）的示意图。（B）三种细胞（HEK-293、U2OS和SH-SY5Y）转导野生型SOD1（WT）和突变型SOD1（A4V）慢病毒后的代表性共聚焦显微图像。（C）三种稳定细胞系经蛋白酶体抑制剂ALLN（10µM）处理24小时后的代表性图像。SOD1A4V-YFP聚集体在HEK-293细胞中大量存在（红色箭头所示），而在U2OS或SH-SY5Y细胞中较少见。图像使用20倍物镜采集。比例尺 = 50 µm。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ALLN (C<sub>20</sub>H<sub>37</sub>N<sub>3</sub>O<sub>4</sub>)	Millipore	208719
MG132 (C<sub>26</sub>H<sub>41</sub>N<sub>3</sub>O<sub>5</sub>)	Sigma-Aldrich	C2211
表霉素 (Epoxomicin) (C<sub>28</sub>H<sub>50</sub>N<sub>4</sub>O<sub>7</sub>)	Sigma-Aldrich	E3652
Hoechst 33342	Invitrogen	H-3570
Opera	Perkin Elmer	OP-QEHS-01
Opera EvoShell 软件	Perkin Elmer	Ver 1.8.1
Operetta	Perkin Elmer	OPRT1288
Harmony 成像软件	Perkin Elmer	Ver 3.0.0
Columbus 图像分析软件	Perkin Elmer	Ver 2.3.2
CyBi Hummingwell 液体处理系统	CyBio AG	OL 3387 3 0110