内毒素活性检测：一种基于化学发光的生物检定法用于检测血液样本中的内毒素活性

摘要

来源：Pinciroli, R. 等. 危重患者全血内毒素血症检测的内毒素活性测定法. J. Vis. Exp. (2019).

本视频展示了一种用于检测全血样本中内毒素活性的快速生物测定方法 通过 一种基于化学发光的方法。该检测是一种快速且灵敏的生物标志物检测方法，用于内毒素介导的脓毒症的早期诊断。

方案

所有涉及人类参与者的操作均遵循机构、国家和国际关于人类福祉的指南，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 内毒素活性检测（EAA）

1. 使用含EDTA抗凝剂的无菌试管采集患者血液样本。将血液样本置于室温保存
2. 为需要检测的每位患者的血液样本准备EA检测管。将试管放入试管架中，然后取下管盖。
3. 每项EA检测包含5种不同类型的试管；每种试管用于检测的不同步骤（参见后续步骤）。
   1. 使用试管#1（“对照”管）测定患者中性粒细胞在无特异性抗体存在时的非特异性氧化爆发基础活性。
   2. 使用试管#2（“样本”管）测定中性粒细胞对脂多糖 (LPS)-抗体复合物的氧化爆发反应。
   3. 使用试管#3（“最大值”管）测定患者中性粒细胞在过量内毒素刺激下的最大氧化爆发活性。
   4. 使用试管#4（“LPS”管）作为外源性内毒素来源。
   5. 使用试管#5（“分装”管）用于血液储存。
      注意： 提供试管#1、#2和#3的重复管，每份待测血液样本共需使用8支试管（EA试剂瓶和质控测试可用于同一包装内的所有检测）。
4. 使用多通道移液器，从试剂瓶中吸取1 mL EA试剂，分别加入试管#1（对照管）、#2（样本管）和#3（最大值管），每管均设重复。
   注意： 沿试管内壁缓慢移液，避免溶液溅出。
5. 轻轻翻转血液采集管20次以混匀患者血液样本。然后向试管#4（LPS最大值管）和试管#5（分装管）各加入0.5 mL患者血液。将试管#4涡旋混匀10秒。
6. 将装有所有EA检测管的试管架放入恒温振荡培养箱中，盖上盖子，在37°C条件下孵育10分钟。
7. 打开盖子，从恒温振荡培养箱中取出试管架。涡旋混匀试管#5（分装管）。使用无菌吸头，向试管#1和#2（每管设重复）各加入40 µL血液。
8. 涡旋混匀试管#4（LPS管）。使用同一移液吸头，从试管#4中吸取40 µL血液加入试管#3（最大值管），每管设重复。
9. 对最终的六支检测管（#1、#2、#3及其重复管）进行涡旋混匀，然后放回试管架中。
   注意： 确保所有试管涡旋混匀的时间相同。
10. 将试管架重新放入恒温振荡培养箱中并关闭盖子。将振荡速度设为100 rpm，开始振荡14分钟。
11. 将EA标记的芯片卡插入化学发光仪并按下启动键。14分钟孵育结束后，按照化学发光仪屏幕上显示的指示，按正确顺序读取EA试管的信号。
12. 在将每支试管放入化学发光仪样品架之前，先轻轻涡旋混匀10秒。打开样品抽屉，将试管#1放入样品架中，关闭抽屉，等待相对光单位（RLU）读数。
13. 对试管2和试管3重复步骤1.12。
14. 对重复管1、2和3重复步骤1.12。
    注意： 在步骤1.12至1.14中，尽量使所有试管的涡旋时间保持一致。
15. 所有试管检测完成后，EA结果将自动计算并打印输出。结果以EA单位表示，取自同一样本重复测定的平均值。
16. 对每份需要检测的血液样本重复步骤1.4至1.15。
17. 检测完成后，将剩余的检测管和EA试剂在2–8 °C条件下保存，可稳定保存最多30天。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
必需氨基酸检测试剂盒	Spectral Medical Inc.	EAAST-20	包含20次检测及1次质控的套装
Smart Line TL	Berthold	EAASL	发光检测仪
恒温振荡培养箱	GRANT	ES-20	小型恒温振荡培养箱
涡旋混合器	VWR	444-2790	涡旋仪