浊度法鲎试剂细胞裂解物检测：一种用于检测和定量纳米制剂药物中内毒素污染的技术

摘要

来源：Neun, B. W. 等，利用鲎变形细胞溶解物（LAL）检测法检测纳米制剂中的内毒素。J. Vis. Exp. (2019)

本视频介绍了使用鲎试剂（Limulus amoebocyte lysate，LAL）浊度法测定聚乙二醇化多柔比星脂质体纳米制剂中内毒素污染程度的方法。内毒素与LAL试剂反应后溶液产生的浊度可用于估算样品中的内毒素含量。

方案

1. 纳米颗粒样品的制备

1. 使用鲎试剂级水制备研究样品。
2. 如果样品的 pH 值不在 6–8 范围内，使用无热原的氢氧化钠或盐酸调节 pH 值。
3. 使用鲎试剂级水对研究样品进行多个稀释度的稀释。确保最高稀释度不超过最大有效稀释倍数（MVD）。

2. 不同LAL格式间常用试剂的制备

1. 使用无热原LAL试剂水稀释浓氢氧化钠储备液，配制浓度为0.1 N的工作液。
2. 使用无热原LAL试剂水稀释浓盐酸储备液，配制终浓度为0.1 N的工作液。
3. 对照标准内毒素（CSE）的配制
   1. 根据生产商提供的分析证书要求对CSE进行重悬。
      注意：有关特定CSE制剂在不同LAL方法中的货号及应用详情，请参见材料表。
4. LAL试剂的配制
   1. 根据生产商提供的分析证书要求对LAL试剂进行重悬。
      注意：有关特定LAL试剂制剂在不同LAL方法中的货号及应用详情，请参见材料表。

3. 浊度LAL试验

1. 标准品的制备
   1. 使用 900 µL 鲎试剂级水和 100 µL CSE，根据需要配制足够数量的中间稀释液，以制备浓度范围为 0.001 至 1 EU/mL 的标准品。
   2. 首先标记试管，并向每支试管中加入 900 μL 鲎试剂级水。然后向其中加入 100 μL 10 EU/mL 溶液，以制备浓度为 1 EU/mL 的标准品。
   3. 按照上述方法进行连续的 10 倍稀释，以制备三个较低浓度的标准品。确认已制备出浓度范围为 0.001 至 1 EU/mL 的四个标准品。
2. 质控品的制备
   1. 将 50 µL 的 1 EU/mL CSE 溶液与 950 µL 鲎试剂级水混合，制备浓度为 0.05 EU/mL 的质控品。
3. 抑制/增强（IEC）对照品的制备
   1. 将 25 µL 的 1 EU/mL CSE 溶液与 475 µL 特定稀释度的待测纳米材料混合，制备浓度为 0.05 EU/mL 的 IEC 对照品。
4. 实验步骤
   1. 提前约 30 分钟开启仪器，使其预热。将检测波长设置为 660 nm，此波长适用于浊度法鲎试剂检测。
   2. 输入用户名和密码进行登录。
   3. 点击计算机屏幕上的对应图标，打开软件（材料表）。
   4. 在软件主界面选择 采集数据。在主界面的 常规 选项卡中相应位置输入测试编号和数据组信息。
   5. 点击 硬件 选项卡。从下拉菜单中选择仪器类型。
   6. 选择鲎试剂浊度法，将检测波长设置为 660 nm，此设置适用于浊度法鲎试剂检测。
   7. 确认屏幕上显示序列号、系统 ID 和串口信息。点击 OK。再次点击 OK 以确认。
   8. 按照样品测试的顺序输入样品编号。使用默认按钮输入阴性对照、标准曲线和测试样品信息。
   9. 为每个样品准备两份平行管，并向预先标记的玻璃试管中分别加入 200 µL（测试比例 4:1）或 100 µL（测试比例 1:1）的阴性对照（水）、标准品、质控品、IEC 对照品和待测纳米颗粒。
   10. 向第一个测试小瓶中加入 50 µL（测试比例 4:1）或 100 µL（测试比例 1:1）的鲎试剂，短暂涡旋混匀，然后插入仪器转盘的测试孔中。若使用 1:1 比例，则鲎试剂体积为 100 µL。
   11. 对其他样品重复上述操作。每次处理一个样品。
        

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氢氧化钠	Sigma	S2770	必要时用于调节样品 pH 值至 6–8 之间
盐酸	Sigma	H9892	必要时用于调节样品 pH 值至 6–8 之间
LAL 试剂	Associates of Cape Cod	T0051	该试剂仅可用于浊度法检测
对照内毒素标准品	Associates of Cape Cod	E0005	该试剂可用于浊度法和凝胶法检测
LAL 级水	Associates of Cape Cod	WP0501	该试剂可用于任何 LAL 检测形式
Glucashield 缓冲液	Associates of Cape Cod	GB051-25	用于防止β-葡聚糖引起的假阳性反应
一次性无内毒素玻璃稀释管（12 × 75 mm）	Associates of Cape Cod	TB240	这些试管可用于全部三种检测方法
一次性无内毒素玻璃反应管（8 × 75 mm）	Associates of Cape Cod	TK100	这些试管可用于浊度法和显色法检测
无热原吸头（体积 0.25 和 1.0 mL）	RAININ	PPT25, PPT10	吸头和移液器可能吸附内毒素并释放浸出物，从而干扰 LAL 检测。选用这些 RAININ 吸头是因为其在 LAL 检测中的最佳性能已得到验证和确认
无热原微量离心管（2.0 mL）	Eppendorf	22600044	可使用其他等效产品
无热原 Combitips（5 mL）	Eppendorf	30089669	可使用其他等效产品
重复移液器	Eppendorf	4982000020	可使用其他等效产品
微量离心机	任何品牌		可使用任何品牌
冰箱（2–8 °C）	任何品牌		可使用任何品牌
涡旋振荡器	任何品牌		可使用任何品牌
冷冻柜（-20 °C）	任何品牌		可使用任何品牌
Pyros Kinetix 或 Pyros Kinetix Flex 检测仪	Associates of Cape Cod	PKF96	可使用其他仪器。但本检测中使用的 LAL 试剂和内毒素标准品可能需要优化。若使用其他仪器，请参考仪器和 LAL 试剂盒制造商提供的说明