凝胶-凝块鲎变形细胞裂解物检测法：一种用于纳米颗粒制剂中细菌内毒素检测的方法

摘要

来源：Neun, B. W. 等，使用鲎试剂（LAL）检测纳米制剂中的内毒素。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频介绍了一种利用鲎血细胞裂解物（来源于鲎的血细胞）进行凝胶法检测纳米制剂中细菌内毒素存在的方法。该检测可用于测试包括基于纳米的制剂在内的药品是否存在内毒素污染。

方案

1. 纳米颗粒样品的制备

1. 用鲎试剂级水制备研究样品。
2. 若样品pH值超出6–8范围，使用无热原的氢氧化钠或盐酸调节pH值。
3. 使用鲎试剂级水对研究样品进行多个稀释度的稀释。确保最高稀释度不超过最大有效稀释倍数（MVD）。

2. 不同LAL格式间常用试剂的制备

1. 使用无热原LAL试剂水稀释浓氢氧化钠储备液，配制浓度为0.1 N的工作液。
2. 使用无热原LAL试剂水稀释浓盐酸储备液，配制终浓度为0.1 N的工作液。
3. 对照标准内毒素（CSE）的配制
   1. 根据生产商提供的分析证书要求对CSE进行重悬。
      注意：有关特定CSE制剂在不同LAL方法中的货号及应用详情，请参见材料表。
4. LAL试剂的配制
   1. 根据生产商提供的分析证书要求对LAL试剂进行重悬。
      注意：有关特定LAL试剂制剂在不同LAL方法中的货号及应用详情，请参见材料表。

3. 凝胶法鲎试剂（LAL）

注意：本实验通过肉眼观察和检测反应管中是否形成凝块，来判断样品中是否存在内毒素。实验步骤如下所述。请使用实验记录表记录结果。该实验记录表并非强制使用，其他记录检测结果的方式也可接受。为方便读者，补充材料中提供了一份实验记录表示例。Lambda（l）表示凝胶法检测的灵敏度，其值为 0.03 EU/mL。

1. 根据需要标记足够数量的反应管，以容纳待分析的测试样本。有关检测中在步骤1、步骤2和步骤3所使用的重复次数的详细信息，请参阅实验台记录表。
2. 每管分装100 μL水、对照品或测试样品。
3. 配制CSE，使其终浓度等于4λ。
4. 将上述标准品100 μL与100 μL水或测试样品混合，使CSE终浓度为2λ。再重复稀释三次，分别得到λ、半λ（1/2λ）和四分之一λ（1/4λ）的浓度。
5. 确保水浴温度为37 °C。
6. 每支试管中加入100 μL裂解液，短暂涡旋混匀，然后将装有所有试管的试管架放入水浴中孵育1小时。
7. 以平稳动作倒置试管。
8. 在实验台记录表上手动记录结果：“+”表示形成坚实凝块，“-”表示无凝块或凝块松散。
9. 按照美国药典细菌内毒素检测法（USP BET 85）进行分析；以实验台记录表作为辅助材料。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LAL试剂	Associates of Cape Cod	G5003	该试剂专用于凝胶凝块法检测
对照内毒素标准品	Associates of Cape Cod	E0005	该试剂可用于浊度法和凝胶凝块法检测
氢氧化钠	Sigma	S2770	必要时用于调节样品pH至6-8之间
盐酸	Sigma	H9892	必要时用于调节样品pH至6-8之间
LAL级水	Associates of Cape Cod	WP0501	该试剂可用于任何LAL检测形式
Glucashield缓冲液	Associates of Cape Cod	GB051-25	用于防止β-葡聚糖引起的假阳性反应
一次性无热原玻璃稀释管，12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	这些试管可用于三种检测方法中的任意一种
一次性无热原玻璃反应管，10 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TS050	这些试管专用于凝胶凝块法检测
无热原吸头，体积为0.25和1 mL	RAININ	PPT25, PPT10	吸头和移液器可能吸附内毒素或释放可浸出物，从而干扰LAL检测。选用这些RAININ吸头是因为其在LAL检测中的最佳性能已得到验证和确认
无热原微量离心管，2.0 mL	Eppendorf	22600044	可使用其他等效产品
无热原Combitips，5 mL	Eppendorf	30089669	可使用其他等效产品
重复移液器	Eppendorf	4982000020	可使用其他等效产品
微量离心机	任何品牌		可使用任何品牌
冰箱，2-8° C	任何品牌		可使用任何品牌
涡旋振荡器	任何品牌		可使用任何品牌
冷冻柜，-20 C	任何品牌		可使用任何品牌
水浴锅，37° C	任何品牌		可使用任何品牌，但重要的是必须关闭水循环或使用非循环式水浴锅，因为水流会影响凝块形成，导致假阴性结果