基于显色聚合物水凝胶的酶筛选检测法：利用合成底物高通量筛选碳水化合物活性酶的方法

摘要

来源：Schückel, J.，等。利用新型不溶性显色底物试剂盒进行碳水化合物降解酶的高通量筛选。J. Vis. Exp. (2016)。

在本视频中，我们演示了一种利用不溶性显色聚合物水凝胶底物进行高通量碳水化合物活性酶筛选的检测方法。酶可将这些底物降解为可溶性的有色产物，通过测定产物的颜色强度即可对其进行定量分析。

方案

1. 检测试剂盒板的活化

1. 向每个孔中加入 200 µl 激活液（随试剂盒提供），以激活 96 孔滤板（含蓝色 CPH-木聚糖）检测试剂盒板（材料列表），然后在室温下静置孵育 10 分钟，无需振荡。
2. 使用真空装置（内置垫片块，并以任意标准透明 96 孔板作为收集板）抽真空，以去除残留的激活液。也可改用离心机，在 2,700 × g 条件下离心 10 分钟，完成此步骤。
3. 通过向每孔加入 100 µl 无菌水清洗 CPH 底物，然后施加真空（或离心力）以去除稳定剂。重复此步骤两次，此时试剂板即可用于后续实验。

2. 酶促反应

注意： 始终以仅含缓冲液的样本作为阴性对照，若可能，还应使用已知特性的酶作为阳性对照。采用符合统计学要求的重复次数。CPH底物在pH 3.0至10.0范围内稳定，每个孔中缓冲液与酶溶液的总体积不应超过180 µl。也可使用植物提取物或培养液代替纯化的酶溶液。

1. 在检测试剂盒板的每个孔中加入 150 µl 100 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.5）和 5 µl endo-纤维素酶溶液（终浓度为 1 U/ml）。
2. 将产物板（可与酶标仪兼容的透明孔板）置于检测试剂盒板下方，以收集反应板在振荡过程中可能泄漏的液体。
3. 将检测试剂盒板在 25 °C 下于水平摇床中以 150 rpm 振荡孵育 30 分钟。
   注意：孵育期间在检测试剂盒板中充分混匀反应体系，对获得一致且可重复的结果至关重要。CPH 底物在高达 90 °C 的条件下仍保持稳定。当检测含有未知酶浓度的培养液与 CPH 底物的反应时，孵育时间应延长至最多 24 小时。需注意，合适的孵育时间取决于酶的活性水平；但通常情况下，若在 24 小时内未检测到活性，则表明该酶可能无法降解所测试的底物。具有活性的酶会将 CPH 底物中的不溶性显色多糖降解为可溶性显色寡糖，后者表现为有颜色的上清液。
4. 将洁净的产物板放入真空装置内，并将间隔块置于其中。
5. 将检测试剂盒板置于上方，施加真空（最大负压为 -60 kPa）。也可使用离心机在 2,700 x g 条件下离心 10 分钟。
   注意：含有显色寡糖的滤液现位于产物板中，可用于后续分析。

3. 检测与定量

1. 通过目视检查，确认产品板中每个孔的液体体积大致相同。
2. 使用酶标仪在 595 nm 处读取收集板中蓝色 CPH-木聚糖的吸光度。
3. 进行数据分析时，从添加了酶的孔的读数中减去仅含缓冲液的阴性对照孔的读数。根据重复孔的数据计算平均值及平均值的标准误差（SEM）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
检测试剂盒板	Glycospot		定制检测试剂盒板
活化溶液	Glycospot		用于活化CPH底物
350 ml接收板间隔块（用于真空多通道装置）	Pall Corporation	5015	间隔块
96孔MultiScreen HV滤膜板， 0.45 µm，透明，非无菌	Millipore	MSHVN4510	检测板
96孔微量板，聚丙烯材质	Greiner Bio-One	651201	洗涤底物后的收集板
Nunc MicroWell 96孔微量板	Thermo Scientific	269620	产物板
隔膜泵 MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	与真空多通道装置配合使用的真空泵
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch & Holm)	水平摇床
SpectraMax M5	Molecular Devices	10067-750 (VWR)	96孔板吸光度读数仪
真空多通道装置	Pall Corporation	5017	真空多通道装置
内切纤维素酶（EGII）（Trichoderma longibrachiatum）	Megazyme	E-CELTR	纤维素酶 [cel]
α-淀粉酶（Bacillus licheniformis）	Megazyme	E-BLAAM	淀粉酶 [amy]