基于不溶性显色生物质的酶筛选：一种评估植物生物质降解酶降解活性的检测方法

摘要

来源：Schückel, J., 等. 利用新型不溶性显色底物试剂盒高通量筛选碳水化合物降解酶。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频演示了一种利用不溶性显色生物质（ICB）筛选可有效降解植物生物质中复杂多糖的酶的检测方法。酶将ICB水解，释放出可溶性染料连接的寡糖，通过比色法分析反应产物来评估酶活性。

方案

1. 采用ICB底物的96孔显色检测法

1. 酶反应
   1. 向每孔含有红色ICB-小麦秸秆的检测试剂盒板中加入150 µl 100 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）和5 µl 31 U/ml endo-木聚糖酶溶液（最终孔内酶浓度：1 U/ml）。
      注意：检测试剂盒板（含有ICB底物的96孔过滤板）的制备方法见相关文献（参见材料列表）。ICB底物在pH 3.0至10.0范围内的缓冲液中稳定。实验中必须设置仅含缓冲液的阴性对照、商品化酶的阳性对照，并采用适当数量的重复样本。
      1. 不要像激活CPH底物板那样激活ICB底物，而是通过用100 µl水洗涤三次并随后进行真空过滤或离心，以去除稳定剂。
   2. 将产物收集板置于底物板下方，以收集在振荡过程中可能从底物板泄漏的液体。
   3. 在25 °C、150 rpm振荡条件下孵育反应体系2小时。
      注意： 活性酶会将ICB底物中的不溶性显色多糖降解为可溶性寡糖，表现为有颜色的上清液。ICB底物在高达90 °C的温度下仍保持稳定。若使用未经纯化的酶（如培养液），应将孵育时间延长至24小时。
   4. 将产物收集板放入真空装置内，并将间隔块置于其中。
   5. 将检测试剂盒板置于上方，施加真空（最大负压-60 kPa）或使用离心机将反应产物从检测试剂盒板过滤至产物收集板的孔中。
      注意： 含有显色寡糖的滤液现已收集在产物收集板中，可用于后续分析。

2. 检测与定量

1. 通过目视检查，确认收集板各孔中的液体体积大致相同。
2. 使用酶标仪在517 nm处测定红色ICB-小麦秸秆样品收集板的吸光度。
3. 进行数据分析时——仅从添加了酶的孔的读数中减去缓冲液空白对照值。根据重复孔的数据计算平均值及平均值的标准误（SEM）。
   注意： 若用于筛选未知酶，建议制备一系列稀释样本，以获得更详细的酶活性动态范围数据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
检测试剂盒板	Glycospot		定制检测试剂盒板
350 ml 接收板间隔块（用于真空多通道装置）	Pall Corporation	5015	间隔块
96孔 MultiScreen HV 滤膜板，0.45 µm，透明，非无菌	Millipore	MSHVN4510	检测板
96孔聚丙烯微量板	Greiner Bio-One	651201	洗涤底物后的收集板
Nunc MicroWell 96孔微量板	Thermo Scientific	269620	产物板
隔膜泵 MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	与真空多通道装置配合使用的真空泵
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch & Holm)	水平摇床
SpectraMax M5	Molecular Devices	10067-750 (VWR)	96孔板吸光度读数仪
真空多通道装置	Pall Corporation	5017	真空多通道装置
endo-β-1,4-木聚糖酶 M4（Aspergillus niger）	Megazyme	E-XYAN4	木聚糖酶 [xyl]