差异性核染色实验：一种通过碘化丙啶与Hoechst双染法检测线粒体靶向抗癌化合物细胞毒性的实验方法

摘要

来源：Pei, J. 等，一种用于准确测定线粒体毒剂细胞毒性的自动化差异核染色检测方法。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种核染色方法，用于检测线粒体靶向抗癌剂（mitocan）对药物敏感型癌细胞及健康细胞变体的细胞毒性作用。利用碘化丙啶和Hoechst染料等DNA结合染料进行双重染色，可清晰区分死细胞与活细胞，从而有助于评估药物的细胞毒性。

方案

1. 细胞毒性检测：实验设置

1. 将目标化合物溶于适当的培养基（无血清或含1%、2.5%或5% FBS的RPMI-1640）中，配制成所需浓度的溶液。
   1. 若需测定单一化合物的细胞毒性（例如确定有效剂量），应将化合物配制成最终浓度的2倍。
   2. 若需测定化合物组合的细胞毒性，应将各化合物配制成最终浓度的4倍。
   3. 通过将相同体积的溶剂与相应培养基混合，制备仅含溶剂的对照组。例如，若待测化合物分别溶解于DMSO和甲醇中，则需分别为每种溶剂设置仅含溶剂的对照组。
2. 将细胞从培养皿或培养瓶中收集至15 mL锥形管中。
3. 取10 µL细胞悬液转移至微量离心管中，加入10 µL 0.4%台盼蓝染色液。使用血细胞计数板对每种来源的细胞分别计数活细胞与死细胞数量。
4. 在200 g 条件下离心5分钟使细胞沉淀，吸除或倾倒上清液。
5. 用适合检测的培养基（无血清或含1%、2.5%、5% FBS的RPMI-1640）重悬细胞沉淀，调整细胞密度至3×10⁵ 个细胞/mL。
   注意1： 细胞密度为3×10⁵ 个细胞/mL时，可实现每孔15,000个细胞的接种密度。接种密度是一个重要参数，理想情况下应在实验前预先确定。确定接种密度时应考虑以下因素：1）细胞大小——通常较大的细胞接种密度较低；2）处理时间——处理时间较长的实验通常采用较低的接种密度；3）细胞分裂速率——增殖速率较高的细胞应以较低密度接种。优化接种密度的具体示例包括：K562细胞（体积较大，处理24小时）——每孔10,000个细胞；MOLM-13细胞（中等大小，处理24小时）——每孔15,000个细胞；MOLM-13细胞（处理48小时）——每孔8,000个细胞；体积较小的健康外周血单个核细胞（PBMCs，处理24小时）——每孔50,000个细胞；原代急性髓系白血病（AML）细胞（处理24小时）——每孔15,000–20,000个细胞。
   注意2： 培养基中FBS的存在可能影响化合物的活性。降低FBS浓度可能使检测结果更易于解释，但也会降低生理相关性。
6. 使用多通道移液器将步骤1.5中的细胞悬液50 µL接种至96孔板的每个孔中。
7. 按以下方式加入化合物：
   1. 对于单一化合物检测，向每孔加入50 µL 2倍浓度的化合物溶液；对于溶剂对照孔，加入含2倍浓度溶剂的检测培养基50 µL。
   2. 对于联合用药检测，向每孔加入两种化合物（4倍浓度溶液）各25 µL；对于单药对照孔，加入25 µL 4倍浓度的化合物溶液和25 µL检测培养基；对于溶剂对照孔，加入50 µL检测培养基或含溶剂的检测培养基。
      注意1： DMSO的最终浓度不应超过0.5%。
      注意2： 由于加样体积较小，建议在加样时使移液器枪头接触孔壁，以确保液体顺利加入。
8. 轻轻敲击或轻摇培养板，确保各孔内液体充分混匀。
9. 将培养板置于37 °C、含5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育适当时间，例如24小时。

2. 细胞毒性检测：Hoechst 33342 与碘化丙啶染色

1. 配制10倍浓度染色液。该溶液需在每次实验前新鲜配制，不可储存。最终染料浓度应在实验前确定。
   1. 对于白血病细胞系和原代白血病细胞，1 mL 10倍染色缓冲液包含10 µL 20 mM Hoechst 33342 和 50 µL 1 mg/mL 碘化丙啶（propidium iodide），溶于无菌PBS中（终浓度：Hoechst 33342 20 µM，PI 5 µg/mL）。
   2. 对于健康外周血单个核细胞（PBMCs），1 mL 10倍染色缓冲液包含10 µL 20 mM Hoechst 33342 和 10 µL 1 mg/mL 碘化丙啶，溶于无菌PBS中（终浓度：Hoechst 33342 20 µM，PI 1 µg/mL）。
      注意：碘化丙啶的终浓度需在实验前确定。应使用一系列PI浓度（1、2.5、5 µg/mL）进行细胞测试，并将Hoechst/PI测定的细胞活力与台盼蓝测定的细胞活力进行比较。上述PI浓度的选择基于培养基对照孔中目标细胞的存活率（白血病细胞系高于~90%，健康PBMCs高于~70%）。
      注意：Hoechst 33342 和碘化丙啶为潜在致癌物，操作时应穿戴适当的个人防护装备。
2. 孵育后，使用多通道移液器向每孔加入10 µL 10倍染色缓冲液。
   注意：为防止交叉污染，确保移液器吸头不接触培养基。
3. 轻轻敲击培养板以混匀并去除气泡，在37 °C下染色15分钟。
4. 将培养板在200 g 条件下离心4分钟，使所有细胞沉降至孔底。用湿润的无尘纸小心擦拭培养板底部，去除可能干扰成像的纤维或碎屑。
   注意1：离心可最大程度确保所有细胞均被成像捕获。通常死亡细胞会脱落并漂浮，导致细胞毒性结果出现偏差。离心可减轻此效应。
   注意2：培养板应在离心后尽快进行成像，理想情况下在15分钟内完成。离心可能降低PI染色的选择性，导致细胞缓慢积累碘化丙啶。尽管PI染色略有增加，但通过成像观察死亡细胞所带来的准确性提升更为重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-脱氧-D-葡萄糖/2-DG	Chem-Impex	50-519-067
3-溴丙酮酸	Alfa Aesar	1113-59-3
96孔板	Greiner Bio-One	655090	黑色或透明平底96孔板
Countess II 自动细胞计数仪	Thermo Fisher
Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测仪	BioTek
Hoechst 33342	Thermo Fisher	62249	20 mM 溶液；终浓度 1:1,000
HyClone 胎牛血清	GE Healthcare	#25-514
m-氯苯腙/CCCP	Sigma Aldrich	C2759
PBS 片剂	Thermo Fisher	BP2944100	1 片 + 200 mL 无菌水 = 1× PBS 溶液
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100×）	Gibco	10378016
碘化丙啶	Thermo Fisher	50-596-072	干粉；储存液 1 mg/mL（溶于 PBS）；终浓度 5 µg/mL（白血病细胞），1 µg/mL（正常外周血单个核细胞）
鱼藤酮	Ark Pharm	AK115691
RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，液体，无菌过滤，适用于细胞培养）	Sigma Aldrich	R8758-500ML
台盼蓝染液（0.4%）	Gibco	15250-061
细胞系
K562	ATCC	CCL-243	慢性髓系白血病细胞系
MOLM-13	ATCC		急性髓系白血病细胞系
MOLT-4	ATCC	CRL-1582	急性淋巴细胞白血病细胞系
OCI-AML2	ATCC		急性髓系白血病细胞系