差异性核染色实验：一种通过碘化丙啶与Hoechst双染法检测线粒体靶向抗癌化合物细胞毒性的实验方法

摘要

来源：Pei, J. 等，一种用于准确测定线粒体毒剂细胞毒性的自动化差异核染色检测方法。J. Vis. Exp. (2020)

本视频展示了一种核染色方法，用于检测线粒体靶向抗癌剂（mitocan）对药物敏感型癌细胞及健康细胞变体的细胞毒性作用。利用碘化丙啶和Hoechst染料等DNA结合染料进行双重染色，可清晰区分死细胞与活细胞，从而有助于评估药物的细胞毒性。

方案

1. 细胞毒性检测：实验设置

1. 将目标化合物溶于适当的培养基（无血清或含1%、2.5%或5% FBS的RPMI-1640）中，配制成所需浓度的溶液。
   1. 若需测定单一化合物的细胞毒性（例如确定有效剂量），应将化合物配制成最终浓度的2倍。
   2. 若需测定化合物组合的细胞毒性，应将各化合物配制成最终浓度的4倍。
   3. 通过将相同体积的溶剂与相应培养基混合，制备仅含溶剂的对照组。例如，若待测化合物分别溶解于DMSO和甲醇中，则需分别为每种溶剂设置仅含溶剂的对照组。
2. 将细胞从培养皿或培养瓶中收集至15 mL锥形管中。
3. 取10 µL细胞悬液转移至微量离心管中，加入10 µL 0.4%台盼蓝染色液。使用血细胞计数板对每种来源的细胞分别计数活细胞与死细胞数量。
4. 在200 g 条件下离心5分钟使细胞沉淀，吸除或倾倒上清液。
5. 用适合检测的培养基（无血清或含1%、2.5%、5% FBS的RPMI-1640）重悬细胞沉淀，调整细胞密度至3×10⁵ 个细胞/mL。
   注意1： 细胞密度为3×10⁵ 个细胞/mL时，可实现每孔15,000个细胞的接种密度。接种密度是一个重要参数，理想情况下应在实验前预先确定。确定接种密度时应考虑以下因素：1）细胞大小——通常较大的细胞接种....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-脱氧-D-葡萄糖/2-DG	Chem-Impex	50-519-067
3-溴丙酮酸	Alfa Aesar	1113-59-3
96孔板	Greiner Bio-One	655090	黑色或透明平底96孔板
Countess II 自动细胞计数仪	Thermo Fisher
Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测仪	BioTek
Hoechst 33342	Thermo Fisher	62249	20 mM 溶液；终浓度 1:1,000
HyClone 胎牛血清	GE Healthcare	#25-514
m-氯苯腙/CCCP	Sigma Aldrich	C2759
PBS 片剂	Thermo Fisher	BP2944100	1 片 + 200 mL 无菌水 = 1× PBS 溶液
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100×）	Gibco	10378016
碘化丙啶	Thermo Fisher	50-596-072	干粉；储存液 1 mg/mL（溶于 PBS）；终浓度 5 µg/mL（白血病细胞），1 µg/mL（正常外周血单个核细胞）
鱼藤酮	Ark Pharm	AK115691
RPMI-1640 培养基（含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，液体，无菌过滤，适用于细胞培养）	Sigma Aldrich	R8758-500ML
台盼蓝染液（0.4%）	Gibco	15250-061
细胞系
K562	ATCC	CCL-243	慢性髓系白血病细胞系
MOLM-13	ATCC		急性髓系白血病细胞系
MOLT-4	ATCC	CRL-1582	急性淋巴细胞白血病细胞系
OCI-AML2	ATCC		急性髓系白血病细胞系