溶血试验：一种体外测定钙离子载体诱导人红细胞裂解的方法

摘要

来源：Bigdelou, P. 等，使用钙离子载体诱导红细胞凋亡。视觉化实验杂志 (2020)。

本视频介绍了一种体外实验方法，用于测定人样本中由钙离子载体诱导的红细胞溶血或裂解。该实验通过定量破裂的红细胞所释放的血红蛋白，来测量溶血百分比。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 从全血中分离红细胞

1. 取500 µL以酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）抗凝的全血（储存于4 °C）加入微量离心管中。
   注意： 全血购自ACD抗凝血。根据供应商说明，每7 mL全血中加入1.5 mL ACD（总体积为8.5 mL）。
2. 将全血在室温（RT）下以700 × g 离心5分钟，用移液器小心移除上层透明血浆及薄层白细胞层，保留下层红细胞层。
3. 配制1 L林格溶液，其中含125 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgSO₄、32 mM HEPES、5 mM葡萄糖和1 mM CaCl₂。通过逐滴加入2 µL的1.0 M NaOH溶液，将pH值调节至7.4。如需配制无葡萄糖林格溶液，按相同步骤操作，但不添加葡萄糖。
4. 用林格溶液将红细胞洗涤2次：将细胞沉淀重悬于1.5 mL林格溶液中，在室温下以700 × g 离心5分钟，弃去上清液。
5. 将40 µL红细胞沉淀重悬于9,960 µL无葡萄糖林格溶液中，最终体积为10 mL，制备成0.4%的红细胞压积。
   注意： 红细胞压积（hematocrit）是指悬浮液中红细胞所占的体积分数。0.4%的红细胞压积即表示悬浮液中含有0.4%的红细胞。
6. 将细胞悬液在37 °C下孵育7天。

2. 使用离子霉素处理红细胞并测量溶血

1. 将1 mg离子霉素钙盐溶解于630 µL二甲基亚砜（DMSO）中，得到终浓度为2 mM的溶液。分装后于-20 °C保存。
2. 取1 mL的0.4%红细胞压积液 步骤1.5 加入0.5 µL的2 mM离子霉素，使终浓度达到1 µM。在37 °C下孵育2小时。
   1. 使用1 mL未用离子霉素处理的压积红细胞作为阴性对照。
3. 将经离子霉素处理和未处理的压积红细胞在700 x g 室温孵育5分钟，去除上清液，保留管底的细胞沉淀。
4. 用1.5 mL林格溶液重悬细胞沉淀，于室温下以700 × g离心5分钟，弃上清液，重复洗涤3次。
5. 为测定溶血，加入1 mL未经处理的0.4%红细胞压积液 步骤1.5 加入微量离心管中，37 °C孵育2小时，作为溶血的阴性对照（0%）。
6. 加入1 mL未经处理的0.4%红细胞压积悬液 步骤 1.5 将样品加入微量离心管中，在室温下以700 × g离心5分钟。弃去上清液，向细胞沉淀中加入1 mL蒸馏水，于37 °C孵育2小时，作为溶血的阳性对照（100%）。
7. 加入1 mL经离子霉素处理的0.4%血细胞比容溶液 步骤 2.2 加入微量离心管中。
8. 将未处理的细胞、处理后的细胞以及置于蒸馏水中的细胞在700 x g条件下离心 g 室温下孵育5分钟。
9. 取200 µL上清液，加入96孔板中。
10. 使用酶标仪在541 nm处测定吸光度。
11. 使用公式 1 计算溶血率：
    %溶血率 = (A_T - A₀)/(A₁₀₀ - A₀)*100
    其中 A₀ 是红细胞在林格氏液中的吸光度，A₁₀₀ 是红细胞在水中的吸光度，而 A_T 为经离子霉素处理的红细胞的吸光度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Fisher Scientific	12-565-331
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
离心	Millipore Sigma	M7157	Eppendorf 5415C 型号
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-100ML
葡萄糖一水合物	Sigma-Aldrich	Y0001745
HEPES缓冲液（1 M）	Fisher Scientific	50-751-7290	4°C 下保存 °C
钙离子霉素钙盐	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	溶于DMSO中，浓度为2 mM。-20℃保存。 °C
KCl	Fisher Scientific	P330-500
MgSO4	Fisher Scientific	M65-500
微量离心管	Fisher Scientific	02-681-5
NaCl	Fisher Scientific	S271-500
Synergy HFM 微孔板读板机	BioTek
ACD抗凝全血	Zen-Bio		4°C 下保存 °C 并升温至 37 °使用前置于 C