Annexin V 结合测定:一种通过磷脂酰丝氨酸标记鉴定凋亡红细胞的基于荧光的技术

摘要

来源:Bigdelou， P. 等人 使用钙离子载体诱导红细胞红 细胞中的作用。（2020 年）

在本视频中，我们演示了 Annexin V 结合测定法，以使用荧光 Annexin V 染色测量红细胞下垂、红细胞程序性细胞死亡的程度。凋亡红细胞显示磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内小叶到外小叶的易位，导致荧光团标记的膜联蛋白 V 与易位的磷脂酰丝氨酸结合，从而发出荧光信号。

方案

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 膜联蛋白-V 结合测定

1. 将 1 mg 离子霉素钙盐溶解在 630 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 中，达到 2 mM 的最终浓度。分装并储存在 -20 °C。
2. 取 1 mL 的 0.4% 血细胞比容，加入 0.5 μL 的 2 mM 离子霉素，以达到 1 μM 的最终浓度。在 37 °C 下孵育 2 小时。
3. 在 RT 下以 700 x g 离心离子霉素处理和未处理的血细胞比容 5 分钟，并去除其上清液，将细胞沉淀留在管底部。
4. 将细胞沉淀悬浮在 1.5 mL 林格溶液中，在 RT 下以 700 x g 离心 5 分钟，然后丢弃上清液，用林格溶液洗涤细胞 3 次。
将
5. 离子霉素处理和未处理的红细胞细胞沉淀重悬于 1 mL 1x 结合缓冲液中。
6. 在 8 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释 2 mL 的 5x 膜联蛋白 V 结合缓冲液，以获得 1x 结合缓冲液。
7. 在结合缓冲液中取 235 μL 细胞悬液，并加入 15 μL Annexin V-Alexa Flour 488 偶联物。
8. 将细胞在室温 （RT） 下在黑暗处孵育 20 分钟。在 RT 下以 700 x g 离心 5 分钟，然后去除上清液。
9. 用 1x 结合缓冲液洗涤细胞 2 次，将细胞沉淀悬浮在 1.5 mL 结合缓冲液中，在 RT 下以 700 x g 离心 5 分钟，然后去除上清液。
将
10. 细胞沉淀重悬于 250 μL 的 1x 结合缓冲液中，用于流式细胞术测量。

2. 流式细胞术

1. 将 200 μL 膜联蛋白 V 染色的红细胞转移到与流式细胞术兼容的 1 mL 圆底聚苯乙烯管中。
2. 登录流式细胞术软件，然后单击 New experiment（新建实验）按钮。单击 New tube（新建管）按钮。选择全局折叠并选择应用分析以测量激发波长为 488 nm 和发射波长为 530 nm 的荧光强度。
3. 将细胞数设置为 20,000 个，以收集用于荧光激活细胞分选 （FACS） 分析。
4. 选择所需的管子，然后单击 load 按钮。单击记录按钮进行前向散射和侧向散射测量。对所有样品重复上述步骤。
5. 右键单击标本按钮，然后单击 Apply batch analysis（应用批量分析）以生成结果文件。
6. 右键单击标本按钮，然后单击生成 FSC 文件。

材料