Annexin V 结合测定:一种通过磷脂酰丝氨酸标记鉴定凋亡红细胞的基于荧光的技术

Abstract

来源:Bigdelou， P. 等人 使用钙离子载体诱导红细胞红 细胞中的作用。（2020 年）

在本视频中，我们演示了 Annexin V 结合测定法，以使用荧光 Annexin V 染色测量红细胞下垂、红细胞程序性细胞死亡的程度。凋亡红细胞显示磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内小叶到外小叶的易位，导致荧光团标记的膜联蛋白 V 与易位的磷脂酰丝氨酸结合，从而发出荧光信号。

Protocol

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 膜联蛋白-V 结合测定

1. 将 1 mg 离子霉素钙盐溶解在 630 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 中，达到 2 mM 的最终浓度。分装并储存在 -20 °C。
2. 取 1 mL 的 0.4% 血细胞比容，加入 0.5 μL 的 2 mM 离子霉素，以达到 1 μM 的最终浓度。在 37 °C 下孵育 2 小时。
3. 在 RT 下以 700 x g 离心离子霉素处理和未处理的血细胞比容 5 分钟，并去除其上清液，将细胞沉淀留在管底部。
4. 将细胞沉淀悬浮在 1.5 mL 林格溶液中，在 RT 下以 700 x g 离心 5 分钟，然后丢弃上清液，用林格溶液洗涤细胞 3 次。
将
5. 离子霉素处理和未处理的红细胞细胞沉淀重悬于 1 mL 1x 结合缓冲液中。
6. 在 8 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中稀释 2 mL 的 5x 膜联蛋白 V 结合缓冲液，以获得 1x 结合缓冲液。
7. 在结合缓冲液中取 235 μL 细胞悬液，并加入 15 μL Annexin V-Alexa Flour 488 偶联物。
8. 将细胞在室温 （RT） 下在黑暗处孵育 20 分钟。在 RT 下以 700 x g

Materials