Annexin V 结合实验：一种基于荧光标记磷脂酰丝氨酸检测凋亡红细胞的荧光技术

摘要

来源：Bigdelou, P.，等。使用钙离子载体诱导红细胞凋亡。视觉化实验杂志 (2020)

在本视频中，我们演示了使用荧光标记的Annexin V染色法检测红细胞程序性死亡（即eryptosis）程度的Annexin V结合实验。凋亡的红细胞会表现出磷脂酰丝氨酸从细胞膜内层向外层的转位，从而促使带有荧光探针标记的Annexin V与转位至外层的磷脂酰丝氨酸结合，进而发出荧光信号。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. Annexin-V 结合实验

1. 将1 mg离子霉素钙盐溶解于630 µL二甲基亚砜（DMSO）中，得到终浓度为2 mM的溶液。分装后于-20 °C保存。
2. 取1 mL 0.4%红细胞压积，加入0.5 µL 2 mM离子霉素，使终浓度为1 µM。在37 °C孵育2小时。
3. 将经离子霉素处理和未处理的红细胞压积在室温下以700 × g离心5分钟，弃去上清液，保留管底的细胞沉淀。
4. 用Ringer溶液洗涤细胞3次：将细胞沉淀重悬于1.5 mL Ringer溶液中，在室温下以700 × g离心5分钟，弃去上清液。
5. 将经离子霉素处理和未处理的红细胞沉淀分别重悬于1 mL 1×结合缓冲液中。
6. 将2 mL 5×Annexin V结合缓冲液与8 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，配制成1×结合缓冲液。
7. 取235 μL含细胞的缓冲液悬液，加入15 μL Annexin V-Alexa Fluor 488偶联物。
8. 将细胞在室温避光条件下孵育20分钟，然后在室温下以700 × g离心5分钟，弃去上清液。
9. 用1×结合缓冲液洗涤细胞2次：将细胞沉淀重悬于1.5 mL结合缓冲液中，在室温下以700 × g离心5分钟，移除上清液。
10. 将细胞沉淀重悬于250 μL 1×结合缓冲液中，用于流式细胞术检测。

2. 流式细胞术

1. 将200 μL经annexin V染色的红细胞转移至适用于流式细胞术的1 mL圆底聚苯乙烯管中。
2. 登录流式细胞仪软件，点击新建实验 按钮。点击新建管 按钮。选择全局表单 ，并选择应用分析 ，以测量激发波长为488 nm、发射波长为530 nm的荧光强度。
3. 设置采集细胞数量为20,000，用于荧光激活细胞分选（FACS）分析。
4. 选择目标试管，点击加载 按钮。点击记录 按钮，进行前向散射和侧向散射测量。对所有样品重复此步骤。
5. 右键点击样本 按钮，然后点击应用批量分析，以生成结果文件。
6. 右键点击样本 按钮，然后点击生成FSC文件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Annexin V Alexa Fluor 488 - 凋亡检测试剂盒	Fisher Scientific	A10788	4 °C 保存
BD FACSAria II 流式细胞仪	BD Biosciences	643177
离子霉素钙盐	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	用DMSO溶解至2 mM，-20 °C 保存
离心机	Millipore Sigma	M7157	型号 Eppendorf 5415C
一次性圆底流式细胞术管	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
DPBS	VWR Life Science	SH30028.02
微量离心管	Fisher Scientific	02-681-5
含ACD的全血	Zen-Bio		4 °C 保存，使用前升温至 37 °C