Caco-2 细胞生物测定法：一种用于测定复杂食物来源中铁生物可利用性的体外方法

摘要

来源：Glahn, R. P. 用于测定食物中铁生物利用度的Caco-2细胞生物测定法。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种用于评估复杂食物来源中铁生物利用度的体外技术。该技术结合了人体消化过程的模拟与分化后的Caco-2细胞对铁的吸收。细胞内铁蛋白的形成作为细胞摄取铁的标志物。

方案

注意：为方便读者参考，以下方法描述了一次生物测定实验中测定20个实验样品铁生物可利用性所需的特定培养条件和材料，以及所需的质量控制措施。由于该生物测定涉及多项细胞培养和体外消化步骤，耗时较长，因此不建议超出此样本数量。

1. 选择样本数量

1. 对于固体或液体食品，确定一个可代表待测样品的食品量。
   1. 在检测某种豆类品种的铁生物利用度时，使用 100–150 g 豆种，并将该样品量加工成均质样品。
   2. 对于强化果汁、乳制品和运动饮料等液体样品，取样前应确保食品充分混匀。
      注意：上述提到的豆种样品量至关重要，可反映这种主粮作物种子之间固有的差异性。

2. 样品制备

1. 处理前用去离子蒸馏水冲洗掉任何食物样品上的土壤和灰尘。
2. 根据实验目的处理适量样品，例如通过烹饪方法或研磨处理。
   注意：在烹饪和处理过程中，必须使用不会成为潜在污染铁来源的炊具和设备。不锈钢设备不会造成污染；然而，石磨研磨机、铸铁炊具以及任何含铁的非不锈钢设备可能会引入大量污染性铁。标准的不锈钢咖啡研磨机通常足以用于研磨。
3. 冷冻干燥并研磨成均一粉末。
   注意：一旦实现均质化，研究表明，每种待测食物进行三次独立的分析重复即可满足要求。
   1. 如果难以达到样品均质性，应调整产品配方或处理方式。若无法实现，则在非均质性不严重的情况下增加重复次数。
   2. 对于大多数均一的固体食物，每次重复使用0.5 g冻干样品。如有必要，每次重复最多可使用1.0 g样品，但需检查使用超过0.5 g是否在响应程度上带来益处。
      注意：固体食物样品量超过0.5 g可能会堵塞透析膜（见下文）。
   3. 液体样品使用1–2 mL。
      注意：液体样品通常无需进行冻干处理。

3. Caco-2 细胞培养

1. 储备培养物
   1. 从认证供应商处获取Caco-2细胞。
   2. 将冻存管中的细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养₂ 在空气环境（恒定湿度）中，使用添加了25 mM HEPES（pH 7.2）、10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌溶液的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）进行培养。
   3. 当获得足够数量的细胞后（通常在培养7-10天后），将细胞以每平方厘米30,000个细胞的密度接种于未包被胶原的培养瓶中².
   4. 根据可用于接种多孔板的细胞数量及所需细胞数量选择合适的培养瓶规格。
      注意通常情况下，T225（225 cm²）培养瓶²）培养瓶最适合用于多孔板（6孔；9.66 cm²）数量为11个的实验²每项生物测定使用（样品比较用10块板，质量对照用1块板）96孔板。
   5. 在培养瓶中培养细胞7天，每隔一天更换一次培养基，第7天用于接种多孔板。
      注意建议从细胞从库存培养开始至后续用于一系列实验时，传代次数不超过10–15代。应限制细胞培养的传代次数，因为过大的传代范围可能导致细胞系发生适应性改变，从而引起模型反应的变异性。
2. 多孔板上的细胞培养
   1. 以每平方厘米50,000个细胞的密度接种Caco-2细胞² 在6孔胶原蛋白包被板中。
      注意：如果在星期三进行此步骤，通常效果最佳。接下来的步骤将阐明为何这一周中的日期是最优选择。
   2. 在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养细胞12天₂ 使用添加了25 mM HEPES（pH 7.2）、10%（v/v）FBS和1%抗生素-抗真菌溶液的DMEM，在空气环境（恒定湿度）中培养。
      注意培养细胞单层超过12天可能导致细胞过度生长。先前的研究已明确表明，在接种后12天，细胞单层已发育成熟，与培养板贴附良好，且反应一致性最佳。若继续培养更长时间（如达19至21天），则会导致细胞过度生长，培养基中的营养物质迅速耗尽，从而形成不健康的单层细胞。
   3. 在12天期间，按照固定的每日时间表，至少每2天更换一次培养基。
   4. 第12天^th 接种后第1天，将培养基更换为2 mL最低必需培养基（MEM [pH 7]），添加10 mM PIPES（哌嗪-N,N'-双[2-乙磺酸]）、1% 抗生素-抗真菌溶液、氢化可的松（4 mg/L）、胰岛素（5 mg/L）、硒（5 μg/L）、三碘甲腺原氨酸（34 μg/L）和表皮生长因子（20 μg/L）。
      注意如果从周三开始接种，则第12天为周一。
   5. 次日（即第13天），移除MEM，加入1 mL MEM（pH 7）。
      注意：此步骤在周二进行。这一天是生物测定的起始日；因此，13天的周期安排具有保持每周时间一致的优势，可确保生物测定始终在相同的星期几进行。

4. 体外 消化

1. 插入环的制备
   1. 使用经酸洗处理的透析膜和硅胶O形环制备无菌插入环图1A).
      注意提前1天（即第12天，星期一）制备插入物，并将其保存在18 MΩ的水中，于4 °C储存，直至使用。
   2. 在生物测定当天（星期二，第13天），将插入物从冰箱中取出，倒掉液体，并用0.5 M HCl替换。在使用前，将其置于超净台中室温下静置至少1小时。
      注意：此步骤应在移除培养板中的 MEM 之前完成。对膜进行酸洗可去除可能存在的铁污染，并对插入环和膜进行灭菌。
   3. 吸出小室中的0.5 M HCl，用无菌18 MΩ水冲洗。随后将其置于无菌18 MΩ水中，室温下存放于超净工作台内，直至使用。
   4. 在含有Caco-2细胞的6孔板的每个孔中插入一个插件，从而构建一个双室系统。将带有插件的培养板放回培养箱中。
      注意：此步骤应在向每个孔中加入1.0 mL新鲜MEM后立即进行（参见步骤3.2.5）。
2. 胃蛋白酶溶液的制备
   1. 实验当天，将 0.145 g 胃蛋白酶溶解于 50 mL 0.1 M HCl 中，配制胃蛋白酶溶液。室温下在摇床中轻轻振荡溶液 30 分钟。
3. 胰酶-胆汁溶液的制备
   1. 同一天实验时，配制 0.1 M NaHCO₃₃ 通过将 2.1 g NaHCO₃ 溶解于₃ 在250 mL的18 MΩ水中的。
   2. 将0.35 g胰酶和2.1 g胆汁提取物溶于175 mL 0.1 M NaHCO₃中₃.
   3. 胰酶和胆汁提取物溶解后，加入87.5 g弱阳离子交换树脂（参见材料表）并在室温下振荡混匀30分钟。
   4. 将悬液倒入大柱中，并收集流出液。
   5. 用额外的 70 mL 0.1 M NaHCO₃ 洗脱柱子₃，将此体积收集到胰酶胆汁溶液中。
      注意树脂的作用是去除胰酶-胆汁提取物中常见的污染物 Fe。
4. 启动 体外 消化
   1. 在无菌的50 mL离心管（聚丙烯材质）中称取样品，随后加入10 mL pH为2的生理盐水，其中含有140 mM NaCl和5 mM KCl。
   2. 加入0.5 mL制备好的猪胃蛋白酶溶液至样品中，启动胃消化过程，在37 °C下于摇床中以低速轻柔振荡孵育1 h。
   3. 在此阶段结束后，通过使用 1.0 M NaHCO₃ 将各样品的 pH 值调节至 5.5–6.0，启动肠道消化过程₃.
   4. 向每个样品管中加入2.5 mL胰酶-胆汁溶液，并用1.0 M NaHCO₃将pH值调节至6.9–7.0₃.
   5. pH调整后，使用140 mM NaCl、5 mM KCl（pH 6.7）溶液平衡各管体积，称量管重，目标值为15 g。
      注意对于某些食物，可能需要将总体积调至16 g或17 g，具体取决于食物的缓冲能力。
   6. 将每份肠道消化液各1.5 mL转移至含Caco-2细胞的6孔培养板相应孔的上室（即含有带透析膜的插入环的上室）中图1B).
   7. 更换培养板盖，于 37 °C（5% CO₂）培养₂ 在摇床（6 次/分钟振荡）上于空气环境中反应 2 小时。
   8. 移除含有消化液的插入环，并向每孔中额外加入 1 mL MEM（pH 7）。
   9. 将细胞培养板放回培养箱（37 °C；5% CO₂）₂ 额外培养22小时（空气环境）。
   10. 22小时后，移除细胞培养基，并向细胞单层中加入2.0 mL的18 MΩ水。
       注意：水会通过渗透作用使细胞裂解。
   11. 将全部细胞裂解液收集至标准聚丙烯微量离心管或类似容器中，用于后续的细胞蛋白和细胞铁蛋白分析。

结果

图1：Caco-2细胞铁吸收实验的插入环装置示意图 (A) Caco-2 细胞及带有附着透析膜的插入环的图像。B) 整体实验流程示意图 体外 在多孔板的单个孔中进行消化处理，并结合Caco-2细胞对铁的吸收。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M HCl	Fisher Scientific	A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 兆欧水			也称为蒸馏去离子水
3,3′,5-三碘-L-甲状腺原氨酸钠盐	Sigma Aldrich Co	T6397
6 孔板	Costar	3506	用于生物测定实验
抗坏血酸	Sigma Aldrich Co	A0278
胆汁提取物	Sigma Aldrich Co	B8631
Caco-2 细胞	美国模式培养物集存库	HTB-37	HTB-37 是一种常见品系。
细胞培养瓶 T225	Falcon	353138
细胞培养瓶 T25	Corning	430639
细胞培养瓶 T75	Corning	430641U
Chelex-100	Bio-Rad Laboratories Inc	142832	在方案中称为弱阳离子交换树脂
胶原蛋白	Corning	354236
透析膜	Spectrum Laboratories	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO	Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基	Gibco	12100046	DMEM
表皮生长因子	Sigma Aldrich Co	E4127-5X.1MG
胎牛血清	R&D Systems	S12450	Optima
HEPES	Sigma Aldrich Co	H3375
氢化可的松-水溶性	Sigma Aldrich Co	H0396
插入环	Corning Costar	未单独出售	Transwell，用于 6 孔板，无膜
胰岛素	Sigma Aldrich Co	I2643
KCl	Sigma Aldrich Co	P9333
大柱	VWR International	KT420400-1530
最低必需培养基	Gibco	41500034	MEM
NaCl	Fisher Scientific	S271
胰蛋白酶	Sigma Aldrich Co	P1750
PIPES 二钠盐	Sigma Aldrich Co	Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
猪胃蛋白酶	Sigma Aldrich Co	P6887 或 (P7012-25G Sigma
硅胶 O 型圈	Web Seal, Inc Rochester NY	2-215S500
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S233
亚硒酸钠	Sigma Aldrich Co	S5261
ZellShield	Minerva Biolabs	13-0050	以 1% 浓度使用，作为抗生素/抗真菌剂，通过 Thomas Scientific 订购