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注意：所有操作必须在II级生物安全柜中进行，且风机需开启，灯光需关闭。
1. 材料准备
注意：所有材料均列于材料表中。
- 在II级生物安全柜中，根据表1配制培养基1、离心用培养基2，以及荧光标记的2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖（2-NBDG 或 FD-葡萄糖）的储存液和工作液。实验全程需避光操作，可通过关闭生物安全柜内所有光源以保护FD-葡萄糖免受光照。
- 使用即用型细胞培养试剂：胰蛋白酶-EDTA、磷酸盐缓冲液（PBS）以及无葡萄糖且无酚红的杜氏改良伊格尔培养基（下文简称无葡萄糖DMEM）。
- 使用20 mL放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液。
注意：在以下部分中，将在有或无胰岛素刺激的3T3-L1成纤维细胞中，比较不同剂量FD-葡萄糖的细胞外耗竭与细胞内摄取情况（图1）。
2. 3T3-L1 细胞培养与维持
- 将3T3-L1小鼠成纤维细胞以每20 mL Medium 1中稀释1×106个细胞的密度，接种于两块96孔板中。每孔加入100 μL细胞悬液，并在加样过程中通过混匀确保悬液均匀。将细胞在37 °C培养箱（5% CO2、95%湿度）中培养48小时，期间不更换培养基，直至细胞融合度达到约70%-80%。
- 通过在相同培养基中继续培养48小时，使细胞保持融合状态并处于饥饿状态。根据所需建立的饥饿分解代谢状态，可将培养时间在24至72小时范围内进行调整。
3. 3T3-L1 细胞的饥饿处理
- 从96孔板的细胞中倾去培养基，用无菌纸巾吸除残留液体。
- 每孔加入100 μL PBS清洗一次，再用无菌纸巾吸除残留液体。
- 每孔加入100 μL无葡萄糖DMEM培养基，孵育40分钟。根据细胞类型、刺激条件和所需的饥饿程度调整孵育时间。
注意：孵育时间可能需要根据季节进行优化。
4. 配制不同浓度的FD-葡萄糖溶液
注意：图1中的实验检测了在有胰岛素刺激和无胰岛素刺激条件下的细胞外和细胞间介质。
- 每种刺激条件使用八个重复（即一个96孔板中的一整行），因此每种刺激条件需准备1 mL的溶液（具体见表2及下文说明）。
- 准备一个96孔板，设置八种不含胰岛素的刺激条件：FD-葡萄糖浓度分别为2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL 和 0 μg/mL（不含FD-葡萄糖的对照）。
- 另准备一个96孔板，设置八种含胰岛素（终浓度为10 μg/mL）的刺激条件：FD-葡萄糖浓度分别为2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL 和 0 μg/mL（不含FD-葡萄糖的对照）。
- 为配制刺激条件，取1 μL的5 mg/mL FD-葡萄糖工作液（见表1），加入999 μL无葡萄糖DMEM培养基中，得到1 mL工作储备液（1:1000稀释，终浓度为5 μg/mL）。
- 使用该工作储备液，在生物安全柜避光条件下，实验前立即在2 mL离心管中分别进行1:2000、1:5000、1:10,000、1:25,000、1:50,000 和 1:100,000 稀释，以获得终浓度分别为2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL 和 0.05 μg/mL的FD-葡萄糖溶液（见表2）。
- 重复步骤4.4，并向上述各条件中分别加入1 μL胰岛素（10 mg/mL，终浓度为10 μg/mL）。
注意：这些样品中胰岛素的终浓度为10 μg/mL = 1.7 nmol/mL。为确保充分混匀，应在加入其他溶液前先将胰岛素加入各离心管中。
5. 处理饥饿处理的3T3-L1细胞
- 孵育40分钟后，从96孔板的每个孔中倾倒出无葡萄糖的DMEM，并用无菌纸巾吸去残留液体。
- 将上述不同处理条件的溶液分别取100 μL（每孔）加入到两块96孔板中某一列的各孔中，同一处理条件的溶液取100 μL（每孔）加入到同一行的各孔中（共八个重复）。标记使用胰岛素和未使用胰岛素的培养板。对照孔中仅加入无葡萄糖的DMEM（n = 8）。
- 将培养板置于细胞培养箱中避光孵育40分钟（37 °C，5% CO2，95%湿度）。
6. 刺激后3T3-L1细胞的细胞外和细胞间测量
- 细胞刺激40分钟后，将两块板中的刺激培养基转移至新的96孔板中，保持相同的实验布局。
- 用无菌纸巾倾去含有细胞的原始96孔板中残留的溶液。
- 可选：用PBS洗涤细胞。去除PBS后，将残留液体在无菌纸巾上倾去。
- 向每个孔中加入100 μL RIPA裂解缓冲液。可选：在RIPA缓冲液中加入蛋白酶抑制剂以保护蛋白质。将含有RIPA的板置于摇床上孵育30分钟。
- 使用微孔板读板仪（材料表），分别在激发（Ex）和发射（Em）波长为485 nm和535 nm的条件下，先测定含细胞外FD-葡萄糖的培养基中的荧光，然后测定30分钟孵育结束后RIPA裂解细胞板中的荧光（见步骤6.4）。
表1：培养基和荧光标记葡萄糖溶液的制备。
| 溶液/培养基 | 组分 |
| 乙醇:DMSO (1:1/v/v) | 乙醇 (200 µL) 和 DMSO (200 µL)，置于 1-1.5 mL 管中；使用细胞培养级乙醇和 DMSO |
| 培养基 1 | DMEM (89 mL)、青霉素/链霉素 (1%) (1 mL) 和小牛血清 (10%) (10 mL)，置于无菌 50 mL 管中 |
| 离心培养基 2 | DMEM (89 mL)、青霉素/链霉素 (1%) (1 mL) 和牛血清 (10%) (10 mL)，置于无菌 50 mL 管中 |
| 储存用 FD-葡萄糖溶液 5 mg/mL (14.5 mM) | FD 葡萄糖 (1 mg) 和 乙醇:DMSO (1:1/v/v) (200 µL)，置于 0.5 mL 管中；于 -80 °C 保存，最好在氩气或氮气氛围下保存 |
| 工作用 FD-葡萄糖溶液 5 µg/mL (14.5 mM) | 储存用 FD 葡萄糖溶液 5 mg/mL (1 µL)、无葡萄糖 DMEM (999 µL)；实验前立即配制 |
表2：用于图1所示实验的不同浓度FD-葡萄糖溶液的配制。
| 稀释倍数 | 对照 | 1:2×103 | 1:5×103 | 1:1×104 | 1:2.5×104 | 1:5×104 | 1:1×105 |
| 浓度 (µg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| 无葡萄糖 DMEM (µL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD 葡萄糖 5 µg/mL (µL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
