小鼠器官离体葡萄糖摄取评估的替代测量技术：细胞外荧光葡萄糖类似物消耗量测定

摘要

来源：Kumar, S. B. 等., 细胞和组织中葡萄糖摄取的间接测量方法：细胞外葡萄糖耗竭 离体. 视频实验杂志 (2022)

在本视频中，我们演示一种离体（ex vivo）技术，用于测量从小鼠器官中分离出的组织对外源性葡萄糖类似物的消耗。该方法包括将小鼠组织置于含有荧光标记的脱氧葡萄糖溶液中孵育，该类似物可被细胞摄取。通过测定孵育后培养基中的荧光强度，可间接评估葡萄糖类似物的摄取情况。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医评审委员会的审核。

注意：所有操作必须在II级生物安全柜中进行，且风机应保持开启，灯光关闭。

1. 材料准备

注意：所有材料均列于材料列表中。

1. 在 II 级生物安全柜中，根据表 1配制培养基 1、离心用培养基 2，以及荧光标记的 2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖（2-NBDG 或 FD-葡萄糖）的储存液和工作液。实验过程中需避光处理 FD-葡萄糖，可通过关闭生物安全柜内所有光源实现。
2. 使用即用型细胞培养试剂：胰蛋白酶-EDTA、磷酸盐缓冲液（PBS）以及无葡萄糖且无酚红的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（下文简称无葡萄糖 DMEM）。

2. 离体 器官中细胞外FD-葡萄糖消耗量的测定

1. 在器官解剖前，对小鼠进行促进葡萄糖代谢的化合物预处理，步骤如下。
2. 使用九周龄的雄性 Lep^ob 小鼠（n = 11）。实验前所有小鼠均饲喂常规饲料。
3. 将小鼠随机分为三组，进行腹腔内（i.p.）注射。
   1. 对照 Lep^ob 组小鼠注射 0.1 mL 无菌 PBS（n = 4）。
   2. 胰岛素 Lep^ob 组小鼠注射含每克体重 12 IU 人胰岛素的无菌 PBS 溶液 0.1 mL（n = 3）。
   3. AAC2 Lep^ob 组小鼠注射含每克体重 0.1 nmol AAC2 的无菌 PBS 溶液 0.1 mL（n = 4）。
4. 注射 15 分钟后，用 5% 异氟烷吸入麻醉小鼠，并通过心脏穿刺放血处死。
5. 解剖每只动物的内脏附睾白色脂肪组织（200 mg）、肝脏（200 mg）和全脑。组织操作需在 II 级生物安全柜中进行。
6. 在 II 级生物安全柜中避光条件下，用无葡萄糖 DMEM 配制 FD-葡萄糖（0.29 mM）工作液。
7. 使用酶标仪在激发波长 485 nm 和发射波长 535 nm 下测定 FD-葡萄糖工作液（0.29 mM）的荧光强度。
8. 将收获的组织/器官置于含 PBS 的 6 孔板中孵育 1 分钟。每种组织或器官分别置于不同的孔中处理。
9. 1 分钟后，将每种组织置于无菌纸巾上以吸除 PBS，然后将组织/器官转移至另一 6 孔板中，每孔含 4,000 µL 无葡萄糖 DMEM，孵育 2 分钟。
10. 2 分钟后，取出组织并转移至新的 6 孔板中，每孔含 0.29 mM FD-葡萄糖工作溶液（1 mL/孔）。将含组织的 6 孔板置于 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度条件下孵育。
11. 在孵育 0、10、20、30、40、60、90 和 120 分钟后，从每个孔中各取 100 µL FD-葡萄糖工作溶液，用于分析细胞外 FD-葡萄糖消耗的动力学。取样前后需充分震荡混匀。
12. 将 100 µL FD-葡萄糖工作溶液转移至 96 孔板，使用酶标仪在激发波长 485 nm 和发射波长 535 nm 下测定荧光强度。
13. 将各时间点的荧光值归一化至 0 分钟时的数值（设为 100%），以表示每只动物每个器官的数据（图 1）。

表1：培养基和荧光素标记葡萄糖溶液的制备。

溶液/培养基	组分
乙醇:DMSO (1:1/v/v)	乙醇 (200 µL) 和 DMSO (200 µL)，置于 1-1.5 mL 管中；使用细胞培养级乙醇和 DMSO
培养基 1	DMEM (89 mL)、青霉素/链霉素 (1%) (1 mL) 和小牛血清 (10%) (10 mL)，置于无菌 50 mL 管中
离心培养基 2	DMEM (89 mL)、青霉素/链霉素 (1%) (1 mL) 和牛血清 (10%) (10 mL)，置于无菌 50 mL 管中
储存用 FD-葡萄糖溶液 5 mg/mL (14.5 mM)	FD 葡萄糖 (1 mg) 和乙醇:DMSO (1:1/v/v) (200 µL)，置于 0.5 mL 管中；于 -80 °C 保存，最好置于氩气或氮气氛围下
工作用 FD-葡萄糖溶液 5 µg/mL (14.5 mM)	储存用 FD 葡萄糖溶液 5 mg/mL (1 µL)、无葡萄糖 DMEM (999 µL)；实验前立即配制。

结果

图1：不同器官中细胞外FD-葡萄糖消耗的动力学 离体. (A-C) Lep^ob 小鼠分别注射了载体（PBS，n = 4）、胰岛素（12 IU/kg 体重，n = 3）和 AAC2（1 nmol/g 体重，n = 3）。给药 15 分钟后，解剖并分离组织。取（A内脏脂肪，（B）肝脏，以及（C) 脑组织在FD-葡萄糖（0...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Falcon	353227	塑料器皿
B6.V-Lepob/J 雄性小鼠	Jackson Laboratory	货号 000632	 小鼠
BioTek Synergy H1 模块化多功能微孔板读板仪（Fisher Scientific, US）	Fisher Scientific, US	Fisher Scientific, US	设备
细胞培养箱	Forma	Series II Water Jacket	设备
饲料（小鼠/大鼠饲料，辐照处理）	Envigo	Teklad LM-485	饲料
异氟烷，5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	麻醉剂
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	细胞培养
青霉素/链霉素（P/S）	Gibco/ThermoFisher	15140-122	细胞培养
无葡萄糖且无酚红的DMEM培养基	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	细胞培养
荧光标记的2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖（2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3- benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose）	Sigma	72987-1MG	检测
杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）	Gibco/ThermoFisher	11965-092	细胞培养
牛血清	Gibco/ThermoFisher	161790-060	细胞培养
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023-500mL	试剂