体外测量平滑肌细胞收缩：利用细胞-基质电容阻抗传感技术评估平滑肌细胞收缩的非侵入性方法

摘要

来源：Bogunovic, N. 等., 分离患者特异性原代主动脉平滑肌细胞及半定量实时收缩测量 体外. 视频实验杂志 (2022).

本视频介绍了利用细胞电极基底阻抗传感技术（ECIS）测量主动脉平滑肌细胞（SMC）收缩的方法。ECIS可检测细胞的运动，是测量细胞收缩的可靠方法。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查

1. 测量收缩（示例：SMCs）

1. 准备一个96w10e ECIS阵列（参见图1A，其中为阵列的代表性图像，包含放大后的电极及接种在电极上的细胞）。
   注意：以下所有步骤均需在无菌组织培养超净工作台内进行。
   1. 每孔加入200 µL 10 mM L-半胱氨酸溶液，对无菌96w10e阵列进行包被，室温孵育30分钟。
   2. 用无菌水洗涤板子两次。将板子置于组织培养罩内，盖子微开，过夜干燥。
      注意：仅在首次使用该板时需要使用L-半胱氨酸进行包被。
   3. 次日，将板子和盖子置于紫外线下灭菌30分钟。将盖子翻转朝上，确保内表面被灭菌。板子灭菌后，不得在超净工作台外打开。
2. 在ECIS阵列上接种细胞
   1. 将1%无菌明胶溶液在水浴中预热30分钟。
      注意：该溶液通常储存于冰箱中，可能凝固，导致移液困难。
   2. 随后，每孔加入100 µL 1%明胶溶液进行包被，并将板子在37 °C孵育至少1小时。
   3. 吸除各孔中的明胶溶液。
   4. 使用自动细胞计数仪计数细胞，并以每孔30,000个细胞的密度，将SMC接种于200 µL SMC培养基中，每组设三个重复。
   5. 将含有SMC的板子放入细胞培养孵箱内的ECIS 96孔支架中。双击ECIS Applied Biophysics软件打开程序，然后点击Setup按钮。
   6. 在左下角标有Well Configuration的面板中，检查所有电极是否与支架接触良好（绿色表示正常连接，红色表示无连接）。若电极连接不良，应在开始测量前调整板子在支架中的位置。
   7. 在同一面板中，点击Array type，选择板子类型（96孔阵列）。
   8. 在右上角的Data Collection Setup面板中，点击single frequency，将阻抗值设为4000 Hz，间隔设为8 s。
   9. 点击Start按钮开始测量。等待新面板弹出，以便保存ECIS数据文件。
   10. 让细胞贴壁并形成单层，持续48小时。
       注意：细胞在电极上的贴附和铺展会产生基线电阻值（参见图1B）。
3. 刺激细胞以诱导收缩
   1. 通过使用10 µg/mL钙离子载体离子霉素刺激细胞，诱导SMC收缩。
      注意：离子霉素将诱导细胞外Ca²⁺内流，激活收缩级联反应；参见图2A，其中为未刺激和刺激后收缩细胞的代表性图像。
   2. 将1 mg离子霉素粉末溶于100 µL二甲基亚砜中，配制成10 mg/mL的储存液，分装为10 µL每管，于-20 °C保存。使用前，将离子霉素溶液用SMC培养基按1:10稀释，制备成工作液用于添加至细胞中。
   3. 在阵列仍位于细胞培养孵箱内支架中、且电极已连接至系统时进行细胞刺激。
      1. 刺激细胞时，取下盖子并将其放置在孵箱内无菌表面上。准备两支移液器，分别设定为2 µL和150 µL。
      2. 开始刺激前，在软件中点击Mark并添加注释。
         注意：这将有助于在数据分析时准确定位刺激发生的时间点。
      3. 尽快向每孔加入2 µL离子霉素工作液。所有细胞刺激完成后，使用第二支移液器混匀各孔中的培养基。
         注意：由于效应迅速，不同细胞系和条件下无需更换枪头。刺激和混匀过程应迅速操作，因为离子霉素具有急性作用。当刺激整块板时，每次最多刺激3列。每次刺激后，需等待至少30分钟再进行下一次刺激，以使细胞从因孵箱门开启导致的温度和CO₂变化中恢复。
      4. 刺激完成后，立即再次点击Mark，添加“刺激已完成”的注释。
4. 结束刺激实验
   1. 在离子霉素刺激后继续记录约5分钟的阻抗值。点击Finish结束记录。

结果

图1：ECIS板的设置及主动脉平滑肌细胞收缩的图示表示。（A）左图：96孔ECIS板。中图：ECIS板单个孔的放大图，显示孔底部的十个电极。右图：在ECIS板上接种的平滑肌细胞的光学显微镜图像；放大倍数10倍。（B）ECIS在三重复接种对照平滑肌细胞后测得的电阻曲线。粗蓝线代表三重复的平均值，虚线代表三重复的标准差（SD）。接种后的最初4-5小时内，平滑肌细胞在整孔表面铺展，测得高电阻（约1000 Ω）。一旦稳定的平滑肌细胞单层形成，电阻随时间逐渐降低至约500 Ω。缩略语：ECIS = 电细胞-基质阻抗传感；SMC = 平滑肌细胞；SD = 标准差。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔阵列	Applied Biophysics	96W10idf PET	用于ECIS系统中测量收缩的阵列
人血管平滑肌细胞基础培养基（原名“Medium 231”）	Gibco	M231500	用于培养平滑肌细胞的培养基
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	472301	用于稀释离子霉素的溶液
Invitrogen Countess II	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	自动细胞计数仪
链球菌来源的钙离子霉素盐	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	用于刺激收缩的化合物
ZTheta	Applied Biophysics	ZTheta	用于收缩测量的ECIS仪器