来源：Tripathi, A.，等。基于体外荧光显微镜运动性检测的肌球蛋白特异性优化方法。J. Vis. Exp. (2021)。
在本视频中，我们进行一项体外运动分析实验，以研究肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互作用。通过荧光显微镜观察固定在表面的肌球蛋白分子上肌动蛋白丝的滑动运动。
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方法文章
滑动肌动蛋白丝检测：一种体外运动检测法，用于研究肌动蛋白丝在固定化肌球蛋白上的易位
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 滑动肌动蛋白丝实验
- 盖玻片制备
- 在乙酸戊酯中配制1%的硝酸纤维素溶液。
- 取一个组织培养皿（150 × 25 mm），在培养皿底部放入一张圆形滤纸（直径125 mm）。
- 将八片厚度为1.5、尺寸为22 mm的方形盖玻片装入支架中，先用约2–5 mL的无水乙醇清洗，再用2–5 mL的去离子水（dH2O）清洗。重复此清洗步骤一次，最后一次以水结束。然后使用过滤空气管线或N2气流将盖玻片完全干燥。
- 取其中一片盖玻片，沿其一侧边缘缓慢加入10 µL的1%硝酸纤维素溶液。随后，用平滑侧壁的200 µL移液枪头侧面一次性均匀涂抹至整个盖玻片表面。将该盖玻片放置于组织培养皿中，硝酸纤维素涂层朝上。对剩余盖玻片重复此操作，并在配制其余试剂期间使其自然干燥。涂覆后的盖玻片需在24小时内使用。
- 流动室制备
- 用光学镜头纸擦拭载玻片，去除较大的碎屑。剪下两段双面胶，每段长约2 cm。
- 将其中一段沿载玻片长边的中央位置粘贴，确保胶带边缘与载玻片边缘对齐。将第二段胶带平行粘贴于第一段下方约2 mm处，使两者对齐。由此形成的流动室可容纳约10 µL溶液（见图1）。
- 从第1部分中取一片已涂覆硝酸纤维素的盖玻片，小心地将其粘附在双面胶上，确保硝酸纤维素涂层一侧直接接触胶带（见图1）。使用移液枪头轻轻按压载玻片与胶带的接触区域，确保盖玻片牢固粘附。用刀片切除超出载玻片边缘的多余胶带。
- 肌动蛋白制备
- 在聚合缓冲液（50 mM KCl、2 mM MgCl2、1 mM DTT、25 mM MOPS，pH 7.0）中，于4 °C过夜聚合球状肌动蛋白（G-actin），制备20 µM的F-肌动蛋白。
- 将F-肌动蛋白用运动缓冲液（20 mM MOPS、5 mM MgCl2、0.1 mM EGTA、1 mM DTT，pH 7.4）稀释至5 µM，并加入至少1.2倍摩尔过量的罗丹明-鬼笔环肽进行标记。避光（用铝箔包裹）冰上孵育至少2小时。该溶液可在冰上保存并使用1–2个月。
- 进行肌球蛋白5a滑动肌动蛋白丝实验
注意：本节提供肌球蛋白5a（HMM）滑动实验的详细步骤。- 配制表1中所述的肌球蛋白5a相关溶液，并置于冰上保存。
- 将10 µL肌球蛋白5a溶液（50–100 nM）注入流动室，静置1分钟。
- 注入10 µL含1 mg/mL BSA、50 mM MB和1 mM DTT的溶液（“低盐”缓冲液）。重复此洗涤步骤两次，第三次洗涤后静置1分钟。用纸巾或滤纸的一角轻轻接触流动室出口，通过毛细作用将溶液引出。
- 用10 µL含50 mM MB和1 mM DTT的缓冲液洗涤，重复此步骤两次。
- 注入10 µL黑色肌动蛋白溶液（含5 µM F-肌动蛋白、1 µM钙调蛋白和1 mM ATP的50 mM MB缓冲液，含1 mM DTT），以去除“失活头部”。
- 在将溶液引入流动室前，使用1 mL注射器和27 G针头反复吹打溶液，以剪切肌动蛋白丝。重复此操作两次，第三次后静置1分钟。约20次吹打即可达到效果。
- 进行“失活头部”离心：在500 mM盐浓度下，将化学计量比的F-肌动蛋白加入肌球蛋白溶液中，同时含有1 mM ATP和1 mM MgCl2，然后在4 °C下以480,000 × g超速离心15分钟。失活的肌球蛋白将存在于沉淀中。
- 注入50 µL含50 mM MB、1 mM DTT和1 mM ATP的缓冲液，以清除流动室中游离的肌动蛋白丝。
- 用10 µL含50 mM MB和1 mM DTT的缓冲液洗涤，重复两次，以彻底清除流动室中的ATP。
- 注入10 µL含20 nM罗丹明标记肌动蛋白（Rh-Actin）和1 mM DTT的50 mM MB缓冲液，静置1分钟，使肌动蛋白丝与附着在盖玻片表面的肌球蛋白5a发生强直结合。
- 用10 µL含50 mM MB和1 mM DTT的缓冲液洗涤，去除未结合到表面的Rh-Actin丝。重复此洗涤步骤两次。
- 注入30 µL终末缓冲液（Final Buffer）。
- 使用激发波长为561 nm的荧光显微镜采集图像，以观察Rh-Actin。推荐的成像参数为：激光功率1.4 mW，曝光时间200 ms，总采集时长0.5–1分钟。
注意：图像采集速率应根据移动丝的速度适当调整。在使用轨迹追踪程序分析数据前，需特别注意采集帧率。帧间亚像素移动会导致速度高估，而要获得准确的速度值，需要达到数百纳米的位移。理想的采集速率应使肌动蛋白丝在相邻帧间滑动至少一个像素的距离。以本实验所用的全内反射荧光（TIRF）显微镜为例，单个像素对应130 nm；因此，对于预期移动速度为1 µm/s的肌球蛋白，应以5帧/秒（0.2秒间隔）进行成像，以实现每帧200 nm的位移；而对于预期速度为10 nm/s的肌球蛋白，则需0.05帧/秒（20秒间隔）。如有必要，可在该阶段对数据进行降采样处理。
表1：滑动实验中使用的缓冲液
| 缓冲液名称 | 组分 (M5a) | 组分 (NM2b) | 使用步骤 (M5a/NM2b) | 备注 |
| 4X 运动缓冲液 (4X MB) | 80 mM MOPS, pH 7.2 | 80 mM MOPS, pH 7.2 | 真空过滤后于 4°C 保存 | |
| 20 mM MgCl₂ | 20 mM MgCl₂ | |||
| 0.4 mM EGTA | 0.4 mM EGTA | |||
| pH 7.4 | pH 7.4 | |||
| 50 mM 盐运动缓冲液 (50 mM MB) | 25% v/v 4X MB | 25% v/v 4X MB | 真空过滤后于 4°C 保存 | |
| 50 mM KCl | 50 mM NaCl | |||
| 用 dH₂O 定容 | 用 dH₂O 定容 | |||
| 500 mM 盐运动缓冲液 (500 mM MB) | 不适用 | 25% v/v 4X MB | 真空过滤后于 4°C 保存 | |
| 500 mM NaCl | ||||
| 用 dH₂O 定容 | ||||
| 肌球蛋白 | 0.05–0.1 µM 肌球蛋白 | 0.2 µM 肌球蛋白 | 4.2 | 置于冰上保存。 |
| 1 mM DTT | 1 mM DTT | |||
| 用 50 mM MB 稀释 | 用 500 mM MB 稀释 | |||
| 1 mg/mL 牛血清白蛋白 (BSA) | 1 mg/mL BSA | 1 mg/mL BSA | 4.3 | 置于冰上保存。 |
| 用 50 mM MB 稀释 | 用 500 mM MB 稀释 | |||
| 1 mM DTT | 1 mM DTT | |||
| 5 µM 未标记 F-肌动蛋白（50 mM MB 中，黑色肌动蛋白） | 5 µM 未标记 F-肌动蛋白 | 5 µM 未标记 F-肌动蛋白 | 4.5 | 置于冰上保存。通过反复吹打 5–10 次或使用注射器剪切肌动蛋白。 |
| 1 μM 钙调蛋白 (CaM) | 1 mM ATP | |||
| 1 mM ATP | 0.2 mM CaCl₂ | |||
| 用 50 mM MB 稀释 | 1 μM CaM | |||
| 1–10 nM 肌球蛋白轻链激酶 (MLCK) | ||||
| 用 50 mM MB 稀释 | ||||
| 含 1 mM DTT 和 1 mM ATP 的 MB | 1 mM DTT | 1 mM DTT | 4.6 | 置于冰上保存。 |
| 1 mM ATP | 1 mM ATP | |||
| 用 50 mM MB 稀释 | 用 50 mM MB 稀释 | |||
| 含 DTT 的 MB | 1 mM DTT | 1 mM DTT | 4.4, 4.7, 4.9 | 置于冰上保存。 |
| 用 50 mM MB 稀释 | 用 50 mM MB 稀释 | |||
| 20 nM 罗丹明-鬼笔环肽标记的 F-肌动蛋白 (Rh-Actin) | 20 nM 罗丹明-鬼笔环肽标记的 F-肌动蛋白 | 20 nM 罗丹明-鬼笔环肽标记的 F-肌动蛋白 | 4.8 | 置于冰上保存。切勿涡旋震荡。 |
| 1 mM DTT | 1 mM DTT | |||
| 用 50 mM MB 稀释 | 用 50 mM MB 稀释 | |||
| 终末缓冲液 | 50 mM KCl | 0.7% 甲基纤维素（可选） | 4.10 | 实验前立即加入葡萄糖、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。置于冰上保存。 |
| 20 mM MOPS, pH 7.2 | 50 mM NaCl | |||
| 5 mM MgCl₂ | 20 mM MOPS, pH 7.2 | |||
| 0.1 mM EGTA | 5 mM MgCl₂ | |||
| 1 mM ATP | 0.1 mM EGTA | |||
| 50 mM DTT | 1 mM ATP | |||
| 1 μM 钙调蛋白 | 50 mM DTT | |||
| 2.5 mg/mL 葡萄糖 | 1–10 nM MLCK | |||
| 100 μg/mL 葡萄糖氧化酶 | 0.2 mM CaCl₂ | |||
| 40 μg/mL 过氧化氢酶 | 1 μM 钙调蛋白 | |||
| 2.5 mg/mL 葡萄糖 | ||||
| 100 μg/mL 葡萄糖氧化酶 | ||||
| 40 μg/mL 过氧化氢酶 |
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结果
图1：功能化流动池室的制备。（A）从一块清洁的显微镜载玻片、两段约2 cm长的双面胶带以及一块功能化盖玻片开始。（B）将胶带贴在载玻片中央。（C）将盖玻片附着在胶带上，使涂层（即硝酸纤维素）朝下，并用塑料移液器吸头轻轻按压盖玻片与胶带重叠的区域，确保盖玻片已牢固粘附于流动室上。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸戊酯 | Ladd Research Industries | 10825 | |
| ATP | Millipore Sigma | A7699 | |
| 牛血清白蛋白 | Millipore Sigma | 5470 | |
| 钙调蛋白 | PMID: 2985564 | ||
| 过氧化氢酶 | Millipore Sigma | C40 | |
| 圆形滤纸 - 滑动实验 | Millipore Sigma | WHA1001125 | |
| 盖玻片架 | Millipore Sigma | Z688568-1EA | |
| 盖玻片：肌动蛋白丝滑动实验 | VWR International | 48366-227 | |
| DL-二硫苏糖醇 | Millipore Sigma | D0632 | |
| 双面胶带 | Office Depot | 909955 | |
| EGTA | Millipore Sigma | E4378 | |
| 乙醇 | Fischer Scientific | A4094 | |
| G-肌动蛋白 | PMID: 4254541 | G-肌动蛋白储备液可在液氮中保存于200 μM浓度。 | |
| 葡萄糖 | Millipore Sigma | G8270 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Millipore Sigma | G2133 | |
| KCl | Fischer Scientific | P217-500 | |
| 大孔移液器吸头 | Fischer Scientific | 02-707-134 | |
| 甲基纤维素 | Millipore Sigma | M0512 | |
| 显微镜载玻片 | Fischer Scientific | 12-553-10 | |
| MOPS | Fischer Scientific | BP308-100 | |
| 硝酸纤维素 | Ladd Research Industries | 10800 | |
| 剃须刀片 | Office Depot | 397492 | |
| 罗丹明-鬼笔环肽 | ThermoFisher Scientific | R415 | 储备液可用100% 甲醇稀释至终浓度200 μM。 |
| 组织培养皿 - 滑动实验 | Corning | 353025 | 每个组织培养皿可容纳约九个盖玻片。 |
| 光滑侧200 µL移液器吸头 | Thomas Scientific | 1158U38 | |
| 仪器设备 | |||
| 离心机 | ThermoFisher Scientific | 75006590 | |
| 显微镜 | Nikon | 型号：Eclipse Ti，配备H-TIRF系统及100x TIRF物镜（数值孔径1.49） | |
| 显微镜相机 | Andor | 型号：iXon DU888 EMCCD相机（1024 x 1024传感器格式） | |
| 显微镜环境控制箱 | Tokai HIT | 定制温控箱 | |
| 显微镜激光单元 | Nikon | LU-n4四激光单元，配备用于405nm、488nm、561nm和640nm的固态激光器 | |
| Optima Max-Xp台式超速离心机 | Beckman Coulter | 393315 |
