来源：Tripathi, A.，等。基于体外荧光显微镜运动分析法的肌球蛋白特异性优化。 J. Vis. Exp. (2021)。
在本视频中，我们进行一项 体外 通过固定化的肌球蛋白分子上肌动蛋白丝的滑动运动来分析肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的运动性实验。利用荧光显微镜观察肌动蛋白丝在固定化肌球蛋白分子上的滑动运动。
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方法文章
倒置运动性分析法：一种在固定化肌动蛋白丝上可视化肌球蛋白运动的体外技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 蛋白质纯化
- 细胞裂解与蛋白质提取
- 根据表1配制1.5倍浓度的提取缓冲液。过滤后于4 °C保存。
- 将细胞沉淀置于冰上开始解冻。在沉淀解冻的同时，向100 mL提取缓冲液中添加1.2 mM二硫苏糖醇（DTT）、5 µg/mL亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、0.5 µM苯甲基磺酰氟（PMSF）以及两片蛋白酶抑制剂片剂。保持在冰上。
- 待沉淀完全解冻后，每10 mL细胞培养物加入1 mL上述补充完整的提取缓冲液。例如，若细胞沉淀来自500 mL细胞培养物，则向沉淀中加入50 mL补充完整的提取缓冲液。
- 在保持冰浴条件下对细胞沉淀进行超声处理。每次处理参数如下：开启5秒，关闭5秒，持续5分钟，功率为4–5。
- 将所有匀浆后的裂解液收集至烧杯中，并加入ATP（0.1 M储存液；pH 7.0），使ATP终浓度为1 mM。在冷室中搅拌15分钟。ATP可使活性肌球蛋白从肌动蛋白上解离，从而在后续离心步骤中实现分离。因此，必须立即进行下一步操作，以尽量减少ATP耗尽及肌球蛋白重新结合肌动蛋白的可能性。
- 在4 °C条件下，以48,000 × g离心裂解液1小时。在此期间，开始用100 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤1–5 mL的50% Anti-FLAG亲和树脂悬液（适用于由1 L细胞形成的沉淀），具体操....
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结果
图1：功能化流动池腔室的制备。（A）从一块清洁的显微镜载玻片、两段约2 cm长的双面胶带以及一块功能化的盖玻片开始。（B）将胶带贴在载玻片中央。（C）将盖玻片附着在胶带上，使涂层面朝下，并用塑料移液管尖轻轻按压盖玻片与胶带重叠的区域，以确保盖玻片已牢固粘附于腔室内。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 M MgCl<sub>2</sub> 溶液 | VWR | 10128-298 | |
| 5 M NaCl 溶液 | KD Medical | RGE-3270 | |
| 乙酸 | 赛默飞世尔科技 | 984303 | |
| 抗FLAG M2亲和凝胶 | Millipore Sigma | A2220 | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf |
| ATP | Millipore Sigma | A7699 | |
| 生物素标记的G-肌动蛋白 | Cytoskeleton, Inc. | AB07 | |
| 牛血清白蛋白 | Millipore Sigma | 5470 | |
| bPEG-硅烷 | Laysan Bio, Inc | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Bradford 试剂浓缩液 | Bio-Rad | 5000006 | |
| 钙调蛋白 | PMID: 2985564 | ||
| 过氧化氢酶 | Millipore Sigma | C40 | |
| 细胞系（Sf9）在SF-900 II无血清培养基中 | 赛默飞世尔科技 | 11496015 | http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf |
| 圆形滤纸-倒置检测法 | Millipore Sigma | WHA1001090 | |
| 完全型无EDTA蛋白酶抑制剂片剂 | Millipore Sigma | 5056489001 | 这应保存在 4 °C. 片剂可直接使用，也可通过将1片溶于2 mL蒸馏水中配制成25倍浓缩液。配制后的溶液可在4℃保存 °C下保存1-2周，或在-20℃下保存至少12周 °C. |
| 超滤管（100,000 截留分子量） | EMD Millipore 公司 | UFC910024 | 截留分子量（MWCO）并非管道的必要属性 "一刀切" 只要截留分子量（MWCO）小于待纯化蛋白质的总分子量即可。M5a 使用截留分子量为 30,000 的超滤管进行浓缩。 |
| 考马斯亮蓝 R-250 染料 | 赛默飞世尔科技 | 20278 | |
| 盖玻片架 | 默克生命科学 | Z688568-1EA | |
| 盖玻片：倒置运动性实验 | Azer Scientific | ES0107052 | |
| 透析管（3500 道尔顿截留分子量） | Fischer Scientific | 08-670-5A | 透析管的直径可以不同，但截留分子量（MWCO）应保持一致。透析管可保存在4℃的20%酒精溶液中。 °C. |
| DL-二硫苏糖醇 | Millipore Sigma | D0632 | |
| 双面胶带 | Office Depot | 909955 | |
| DYKDDDDK 肽 | GenScript | RP10586 | 这可以溶解于含有 0.1 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN3 和 10 mM MOPS（pH 7.2）的缓冲液中，终浓度为 50 mg/mL。可于 -20 ℃ 保存。 °C as 300 µL 样品 aliquots。 |
| EGTA | Millipore Sigma | E4378 | |
| 洗脱柱 | Bio-Rad | 761-1550 | 这些可重复使用。清洗时，用 2–3 柱体积的 PBS 和蒸馏水冲洗层析柱。将层析柱在 4 °C 冷藏保存° 使用前置于冰上。 |
| 乙醇 | Fischer Scientific | A4094 | |
| 葡萄糖 | 默克生命科学 | G8270 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Millipore Sigma | G2133 | |
| 100 mM 甘氨酸缓冲液，pH 2–2.5，1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-295018 | |
| HCl | Millipore Sigma | 320331 | |
| KCl | Fischer Scientific | P217-500 | |
| 大孔径移液器吸头 | Fischer Scientific | 02-707-134 | |
| 亮肽素蛋白酶抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | 78435 | |
| Mark12 未染色标准蛋白条带 | 赛默飞世尔科技 | LC5677 | |
| 甲醇 | Millipore Sigma | MX0482 | |
| 显微镜载玻片 | Fischer Scientific | 12-553-10 | |
| MOPS | Fischer Scientific | BP308-100 | |
| mPEG-硅烷 | 莱桑生物公司 | MPEG-SIL-2000-1g | |
| NaN<sub>3</sub> | Millipore Sigma | S8032 | |
| NeutrAvidin | 赛默飞世尔科技 | 31050 | |
| NuPAGE 4 至 12% Bis-Tris Mini 蛋白质凝胶，15 孔 | 赛默飞世尔科技 | NP0323PK2 | |
| NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X) | 赛默飞世尔科技 | NP0007 | |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | 赛默飞世尔科技 | 10010023 | |
| PMSF | Millipore Sigma | 78830 | PMSF 可用异丙醇配制成 0.1 M 的储存液，并保存于 4 ℃ °C. 加入异丙醇会导致晶体析出，可通过室温搅拌使其溶解。使用前应立即将PMSF逐滴加入快速搅拌的溶液中，终浓度为0.1 mM。 |
| 剃刀刀片 | Office Depot | 397492 | |
| 罗丹明-鬼笔环肽 | 赛默飞世尔科技 | R415 | 储备液可用100%甲醇稀释至终浓度为200 μM. |
| Sf9 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 12658-027 | 这应保存在4℃° C. 其保质期为自生产日期起18个月。 |
| 组织培养皿 - 倒置实验 | 康宁 | 353003 | 每个组织培养皿大约可容纳四个盖玻片。 |
| 光滑侧面 200 µL 吸头 | Thomas Scientific | 1158U38 | |
| <强>仪器设备</strong> | |||
| 离心 | 赛默飞世尔科技 | 75006590 | |
| 显微镜 | 尼康 | 型号：Eclipse Ti 配备 H-TIRF 系统，100x TIRF 物镜（数值孔径 1.49） | |
| 显微镜相机 | Andor | 型号：iXon DU888 EMCCD 相机（1024 × 1024 传感器格式） | |
| 显微镜环境控制箱 | Tokai HIT | 定制温控箱 | |
| 显微镜激光单元 | 尼康 | LU-n4 四激光器单元，配备用于405 nm、488 nm、561 nm和640 nm的固态激光器 | |
| 中型台式离心机 | 赛默飞世尔科技 | 型号：CR3i | |
| Misonix 超声波破碎仪 | Misonix | XL2020 | |
| Optima Max-Xp 台式超速离心机 | 贝克曼库尔特 | 393315 | |
| 等离子清洗机 | Diener electronic GmbH + Co. KG | 系统类型：Zepto | |
| 超声波破碎探头（3.2 mm） | Qsonica | 4418 | |
| 标准培养箱 | 结合剂 | 模型：56 | |
| Waverly 试管混合器 | Waverly | TR6E |
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