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方法文章

倒置运动性分析法：一种在固定化肌动蛋白丝上可视化肌球蛋白运动的体外技术

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⸱

2025年7月8日

本文内容

摘要

来源：Tripathi, A.，等。基于体外荧光显微镜运动分析法的肌球蛋白特异性优化。 J. Vis. Exp. (2021)。

在本视频中，我们进行一项 体外 通过固定化的肌球蛋白分子上肌动蛋白丝的滑动运动来分析肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的运动性实验。利用荧光显微镜观察肌动蛋白丝在固定化肌球蛋白分子上的滑动运动。

方案

1. 蛋白质纯化

  1. 细胞裂解与蛋白质提取
    1. 根据表1配制1.5倍浓度的提取缓冲液。过滤后于4 °C保存。
    2. 将细胞沉淀置于冰上开始解冻。在沉淀解冻的同时，向100 mL提取缓冲液中添加1.2 mM二硫苏糖醇（DTT）、5 µg/mL亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、0.5 µM苯甲基磺酰氟（PMSF）以及两片蛋白酶抑制剂片剂。保持在冰上。
    3. 待沉淀完全解冻后，每10 mL细胞培养物加入1 mL上述补充完整的提取缓冲液。例如，若细胞沉淀来自500 mL细胞培养物，则向沉淀中加入50 mL补充完整的提取缓冲液。
    4. 在保持冰浴条件下对细胞沉淀进行超声处理。每次处理参数如下：开启5秒，关闭5秒，持续5分钟，功率为4–5。
    5. 将所有匀浆后的裂解液收集至烧杯中，并加入ATP（0.1 M储存液；pH 7.0），使ATP终浓度为1 mM。在冷室中搅拌15分钟。ATP可使活性肌球蛋白从肌动蛋白上解离，从而在后续离心步骤中实现分离。因此，必须立即进行下一步操作，以尽量减少ATP耗尽及肌球蛋白重新结合肌动蛋白的可能性。
    6. 在4 °C条件下，以48,000 × g离心裂解液1小时。在此期间，开始用100 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤1–5 mL的50% Anti-FLAG亲和树脂悬液（适用于由1 L细胞形成的沉淀），具体操作依照制造商说明书进行。例如，对于5 mL树脂，洗涤10 mL的50%悬液。在最后一次洗涤步骤中，用适量PBS重悬树脂，使其形成50%悬液。
    7. 裂解液离心完成后，将上清液与洗涤后的树脂悬液混合，在冷室中轻轻摇动孵育1–4小时。等待期间，配制表1中所述缓冲液并置于冰上保存。
  2. FLAG亲和纯化准备
    1. 将步骤1.7中的溶液在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。树脂将沉降至管底。在不扰动树脂的前提下，移除上清液。
    2. 用表1中所述的Buffer A重悬树脂，总体积为50 mL，在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。在不扰动树脂的前提下，移除上清液。
    3. 用表1中所述的Buffer B重悬树脂，总体积为50 mL，在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。重复此步骤一次，然后用20 mL Buffer B重悬树脂。随后，通过手动轻轻倒置试管约10次，充分混匀树脂与缓冲液。
  3. 蛋白质洗脱与浓缩
    1. 按照表1配制30 mL洗脱缓冲液，并置于冰上预冷。
    2. 在冷室中安装洗脱柱。将树脂悬液轻轻倒入柱中。当树脂在柱底部沉降时，用1–2柱体积的Buffer B洗涤柱子，确保树脂不干燥。
    3. 使1 mL洗脱缓冲液流经树脂，收集流出液至1.5 mL离心管中。重复该过程，共收集12个1 mL的组分。
    4. 此时，对各组分进行粗略的Bradford检测，以定性判断哪些组分浓度最高。在96孔板的一行中，每孔加入60 µL 1× Bradford试剂。随着组分的收集，每孔加入20 µL对应组分并混匀。颜色越深的蓝色表示该组分浓度越高。
    5. 在50 mL离心管中，通过轻轻将剩余洗脱缓冲液推过柱子，收集残留的蛋白质，以释放柱中仍结合在树脂上的任何剩余肌球蛋白。此流出液将在下一步进行浓缩。确保之后按照制造商说明书对树脂进行再生并妥善保存，以便重复使用。
    6. 合并浓度最高的三个组分，并将50 mL管中的流出液以及其余1 mL组分使用100,000 MWCO浓缩管进一步浓缩。将合并后的样品加载至浓缩管中，在4 °C条件下以750 × g离心15分钟，重复操作直至所有洗脱蛋白浓缩至最终体积约0.5–1 mL。
      注意：该孔径可有效截留分子量远高于截留分子量的肌球蛋白分子。在此浓缩过程中，轻链仍紧密结合于马达结构域，这一点已通过最终产物的SDS-PAGE凝胶电泳验证。
  4. 透析与速冻
    1. 按照表1配制2 L透析缓冲液。将样品装入透析袋或透析装置中，在冷室中透析过夜。
      注意：对于M5a-HMM，在过夜透析后，蛋白质纯度已足够用于后续实验。如有需要，可进一步进行凝胶过滤或离子交换层析等纯化步骤。
  5. 透析后回收肌球蛋白
    1. 对于M5a-HMM，小心地从透析装置中收集全部样品，并在4 °C条件下以49,000 × g离心15分钟，以去除可能存在的非特异性聚集体。取上清液备用。
  6. 浓度测定与速冻保存
    1. 为测定产物浓度，使用分光光度计在260、280、290和320 nm波长下测量吸光度。利用公式1计算浓度（单位为mg/mL，cmg/mL），其中A280表示280 nm处的吸光值，A320表示320 nm处的吸光值。所得mg/mL浓度可通过公式2换算为肌球蛋白分子的µM浓度，其中M为整个蛋白质的分子量（包括重链、轻链、荧光基团及所有标签）。
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε （1）
      μM 分子 = 1000cmg/mL/M （2）
      注意：若需稀释，必须使用高离子强度缓冲液。消光系数（ε）可通过将蛋白质氨基酸序列导入ExPASy等程序进行计算。本实验中M5a-HMM的典型产量约为0.5–1 mL，浓度为1–5 mg/mL。本文所用M5a-HMM的消光系数为0.671。
    2. 以以下两种方式之一储存纯化的肌球蛋白。将10–20 µL分装至薄壁管（如聚合酶链式反应管）中，迅速将管子浸入液氮中进行速冻。或者，直接将20–25 µL肌球蛋白滴入液氮中，将形成的蛋白冻珠储存于无菌低温冻存管中。无论采用哪种方式，所得样品管均可于-80 °C或液氮中长期保存以备后续使用。
      注意：由于下文所述的运动活性实验仅需极少量蛋白，因此按上述方法分装保存具有经济性。

2. 单分子TIRF检测

  1. 盖玻片准备
    1. 将储备粉末分装为每份10 mg的甲氧基聚乙二醇硅烷（mPEG）和每份10 mg的生物素聚乙二醇硅烷（bPEG），分别置于1.5 mL离心管中。于-20 ℃保存 °在密封、无水的容器中保存，并在6个月内使用。
    2. 将八片1.5H号（高精度）厚度为22 mm的方形盖玻片装入支架中，先用2–5 mL的200-proof乙醇清洗，再用2–5 mL蒸馏水清洗。重复此清洗步骤一次，最后以蒸馏水结束。随后，使用压缩空气或氮气彻底吹干盖玻片2 并用氩气等离子清洗3分钟。
    3. 将洁净的盖玻片置于组织培养皿（100 × 20 mm）中的滤纸（90 mm）上，并在70℃下孵育 °在执行以下步骤时，将 C 放入烘箱。
      注意等离子清洗可替换为其他化学清洗方法。
    4. 用 dH₂O 配制 80% 乙醇溶液2用 HCl 调节 pH 至 2.0。取 1 mL 该溶液加入一份含 10 mg mPEG 的样品中，另取 1 mL 加入一份含 10 mg bPEG 的样品中。涡旋振荡以溶解，时间不应超过 30 秒。
    5. 取100 µL 的 bPEG 溶液并加入 900 µ80% 乙醇（pH 2.0）中的 bPEG 溶液，浓度为 1 mg/mL。然后按如下方法配制两种 PEG 的混合溶液，并充分混匀。
      1. 200 µ10 mg/mL mPEG 的 L（终浓度：2 mg/mL）。
      2. 10 µL 的 1 mg/mL bPEG（终浓度：10 µg/mL
      3. 790 µ80% 乙醇（pH 2.0）溶液的升数。
    6. 将盖玻片从烘箱中取出。小心地加入 100 µ将 PEG 溶液滴加到每张盖玻片的中心，确保仅上表面湿润。然后将盖玻片放回烘箱，孵育 20 至 30 分钟。
    7. 当盖玻片表面开始呈现多孔状，出现明显的微小圆圈时，将其从烘箱中取出。
    8. 用100%乙醇清洗每片盖玻片，用压缩空气吹干，然后放回烘箱中。仅孵育步骤2中形成腔室所需的时间。
  2. 腔室制备
    1. 清洁载玻片以用于制作观察室。剪取两段双面胶，每段长约2 cm。
    2. 将一条胶带沿载玻片长边的中线放置，确保胶带边缘与载玻片边缘对齐。在第一条胶带下方约2 mm处平行且对齐地放置第二条胶带。
    3. 从烘箱中取出一张已功能化的盖玻片（见步骤 2.1 制备）。小心地将盖玻片粘贴到胶带上，确保 PEG 涂层一侧朝下，直接与胶带接触，如图所示 图1用移液器吸头轻轻按压盖玻片与胶带的交界处，以确保盖玻片已牢固粘附在载玻片上。
    4. 用剃刀片将载玻片上多余的胶带剪去。这些培养腔可立即使用，也可成对放入50 mL离心管中，于-80 °C保存 °C 冷冻保存以备将来使用。立即储存至关重要，否则表面会降解。
  3. 进行肌球蛋白5a的全内反射荧光显微镜检测
    1. 制备用于肌球蛋白5a倒置运动性测定的溶液，具体如下所述 表2 并将其置于冰上保存。
    2. 用10洗涤腔室 µ50 mM MB 溶液配制于 1 mM DTT 中
    3. 10 的流速 µ1 mg/mL BSA 的 50 mM MB 溶液（含 1 mM DTT）中孵育。重复此洗涤步骤两次，第三次洗涤后等待 1 分钟。用滤纸或纸巾的一角通过通道吸去溶液。
    4. 用10洗涤 µ50 mM MB 溶液中加入 1 mM DTT，洗涤一次。重复此洗涤步骤两次。
    5. 10 的流速 µ在50 mM MB缓冲液（含1 mM DTT）中加入L体积的NeutrAvidin溶液，孵育1分钟。
    6. 用10洗涤 µ50 mM MB 溶液中加入 1 mM DTT，洗涤一次。重复此洗涤步骤两次。
    7. 10 的流速 µ含1 mM DTT的50 mM MB缓冲液中，加入生物素标记的罗丹明肌动蛋白（bRh-Actin），混匀后静置1分钟。此步骤应使用宽口移液枪头，避免反复吹打，以最大限度减少荧光肌动蛋白丝的剪切，确保长的肌动蛋白丝能够结合至表面（20–30 µ米或更长）。一种有效的替代方法是剪去标准移液器吸头的尖端（开口为 ≈1–1.5 mm
    8. 用10洗涤 µ50 mM MB 溶液中加入 1 mM DTT，洗涤一次。重复此洗涤步骤两次。
    9. 30 的流速 µ加入10 nM肌球蛋白5a的终末缓冲液L，立即上样至TIRF显微镜，找到TIRF成像模式的最佳焦平面后开始记录。在1.4 mW激光功率下，肌动蛋白和GFP标记的肌球蛋白的曝光时间选择100–200 ms较为合适。进行速度分析时，合适的采集时间为3分钟。

表1：蛋白质纯化中使用的缓冲液。

缓冲液名称成分使用步骤备注
M5a 提取缓冲液0.3 M NaCl1.1置于冰上保存。
15 mM MOPS, pH 7.2
15 mM MgCl2
1.5 mM EGTA
4.5 mM NaN3
缓冲液 A0.5 M NaCl2.2置于冰上保存。
10 mM MOPS, pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3
1 mM ATP
1 mM DTT
5 mM MgCl2
缓冲液 B0.5 M NaCl2.3置于冰上保存。
10 mM MOPS, pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3
1 mM DTT
洗脱缓冲液0.5 M NaCl3.1置于冰上保存。
0.5 mg/mL FLAG 肽段
10 mM MOPS, pH 7.2
0.1 mM EGTA
3 mM NaN3
pH 7.2
M5a 透析缓冲液500 mM KCl 4.1使用冷的 dH2O 定容。
10 mM MgCl2
10 mM MOPS, pH 7.2
0.1 mM EGTA
1 mM DTT

表2：TIRF实验中使用的缓冲液。

缓冲液名称组成使用步骤备注
4X 运动缓冲液 (4X MB)80 mM MOPS, pH 7.2真空过滤后于 4°C 保存
20 mM MgCl2
0.4 mM EGTA
pH 7.4
50 mM 盐运动缓冲液 (50 mM MB)25% v/v 4X MB真空过滤后于 4°C 保存
50 mM KCl
用 dH2O 定容
150 mM 盐运动缓冲液 (150 mM MB)真空过滤后于 4°C 保存
肌球蛋白参见“终末缓冲液”配方置于冰上保存。
2 mg/mL NeutrAvidin2 mg/mL NeutrAvidin3.5置于冰上保存。
1 mM DTT
用 50 mM MB 稀释
1 mg/mL 牛血清白蛋白 (BSA)1 mg/mL BSA3.3置于冰上保存。
1 mM DTT
用 50 mM MB 稀释
200 nM 罗丹明-鬼笔环肽生物素化 F-肌动蛋白 (bRh-Actin)200 nM 罗丹明-鬼笔环肽生物素化 F-肌动蛋白3.7避免涡旋或反复吹打以防止剪切；混合时请轻轻颠倒混匀。
1 mM DTT
用 50 mM MB 稀释
含 DTT 的 MB 缓冲液 (MB with DTT)50 mM DTT3.2, 3.4, 3.6, 3.8置于冰上保存。
用 50 mM MB 稀释
终末缓冲液50 mM KCl3.9实验前立即加入葡萄糖、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。置于冰上保存。
20 mM MOPS, pH 7.2
5 mM MgCl2
0.1 mM EGTA
1 mM ATP
50 mM DTT
1 μM 钙调蛋白
2.5 mg/mL 葡萄糖
100 μg/mL 葡萄糖氧化酶
40 μg/mL 过氧化氢酶
10 nM 肌球蛋白

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结果

用于功能化过程的显微镜载玻片装置示意图，显示盖玻片和双面胶带。
图1：功能化流动池腔室的制备。（A）从一块清洁的显微镜载玻片、两段约2 cm长的双面胶带以及一块功能化的盖玻片开始。（B）将胶带贴在载玻片中央。（C）将盖玻片附着在胶带上，使涂层面朝下，并用塑料移液管尖轻轻按压盖玻片与胶带重叠的区域，以确保盖玻片已牢固粘附于腔室内。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 M MgCl<sub>2</sub>&nbsp;溶液VWR10128-298
5 M NaCl 溶液KD MedicalRGE-3270
乙酸赛默飞世尔科技984303
抗FLAG M2亲和凝胶Millipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
生物素标记的G-肌动蛋白Cytoskeleton, Inc.AB07
牛血清白蛋白Millipore Sigma5470
bPEG-硅烷Laysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford 试剂浓缩液Bio-Rad5000006
钙调蛋白PMID: 2985564
过氧化氢酶Millipore SigmaC40
细胞系（Sf9）在SF-900 II无血清培养基中赛默飞世尔科技11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
圆形滤纸-倒置检测法Millipore SigmaWHA1001090
完全型无EDTA蛋白酶抑制剂片剂Millipore Sigma5056489001这应保存在 4 &deg;C. 片剂可直接使用，也可通过将1片溶于2 mL蒸馏水中配制成25倍浓缩液。配制后的溶液可在4℃保存 &deg;C下保存1-2周，或在-20℃下保存至少12周 &deg;C.&nbsp;
超滤管（100,000 截留分子量）EMD Millipore 公司UFC910024截留分子量（MWCO）并非管道的必要属性 "一刀切" 只要截留分子量（MWCO）小于待纯化蛋白质的总分子量即可。M5a 使用截留分子量为 30,000 的超滤管进行浓缩。
考马斯亮蓝 R-250 染料赛默飞世尔科技20278
盖玻片架默克生命科学Z688568-1EA
盖玻片：倒置运动性实验Azer ScientificES0107052
透析管（3500 道尔顿截留分子量）Fischer Scientific08-670-5A透析管的直径可以不同，但截留分子量（MWCO）应保持一致。透析管可保存在4℃的20%酒精溶液中。 &deg;C.
DL-二硫苏糖醇Millipore SigmaD0632
双面胶带Office Depot909955
DYKDDDDK 肽GenScriptRP10586这可以溶解于含有 0.1 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN3 和 10 mM MOPS（pH 7.2）的缓冲液中，终浓度为 50 mg/mL。可于 -20 ℃ 保存。 &deg;C as 300 &micro;L 样品 aliquots。&nbsp;
EGTAMillipore SigmaE4378
洗脱柱Bio-Rad761-1550这些可重复使用。清洗时，用 2–3 柱体积的 PBS 和蒸馏水冲洗层析柱。将层析柱在 4 °C 冷藏保存&deg; 使用前置于冰上。
乙醇Fischer ScientificA4094
葡萄糖默克生命科学G8270
葡萄糖氧化酶Millipore SigmaG2133
100 mM 甘氨酸缓冲液，pH 2–2.5，1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
大孔径移液器吸头Fischer Scientific02-707-134
亮肽素蛋白酶抑制剂赛默飞世尔科技78435
Mark12 未染色标准蛋白条带赛默飞世尔科技LC5677
甲醇Millipore SigmaMX0482
显微镜载玻片Fischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-硅烷莱桑生物公司MPEG-SIL-2000-1g
NaN<sub>3</sub>Millipore SigmaS8032
NeutrAvidin赛默飞世尔科技31050
NuPAGE 4 至 12% Bis-Tris Mini 蛋白质凝胶，15 孔赛默飞世尔科技NP0323PK2
NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X)赛默飞世尔科技NP0007
磷酸盐缓冲液，pH 7.4赛默飞世尔科技10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSF 可用异丙醇配制成 0.1 M 的储存液，并保存于 4 ℃ &deg;C. 加入异丙醇会导致晶体析出，可通过室温搅拌使其溶解。使用前应立即将PMSF逐滴加入快速搅拌的溶液中，终浓度为0.1 mM。&nbsp;
剃刀刀片Office Depot397492
罗丹明-鬼笔环肽赛默飞世尔科技R415储备液可用100%甲醇稀释至终浓度为200 &mu;M.
Sf9 培养基赛默飞世尔科技12658-027这应保存在4℃&deg; C. 其保质期为自生产日期起18个月。
组织培养皿 - 倒置实验康宁353003每个组织培养皿大约可容纳四个盖玻片。
光滑侧面 200 &micro;L 吸头Thomas Scientific1158U38
<强>仪器设备</strong>
离心赛默飞世尔科技75006590
显微镜尼康型号：Eclipse Ti 配备 H-TIRF 系统，100x TIRF 物镜（数值孔径 1.49）
显微镜相机Andor型号：iXon DU888 EMCCD 相机（1024 × 1024 传感器格式）
显微镜环境控制箱Tokai HIT定制温控箱
显微镜激光单元尼康LU-n4 四激光器单元，配备用于405 nm、488 nm、561 nm和640 nm的固态激光器
中型台式离心机赛默飞世尔科技型号：CR3i
Misonix 超声波破碎仪MisonixXL2020
Optima Max-Xp 台式超速离心机贝克曼库尔特393315
等离子清洗机Diener electronic GmbH + Co. KG系统类型：Zepto
超声波破碎探头（3.2 mm）Qsonica4418
标准培养箱结合剂模型：56
Waverly 试管混合器WaverlyTR6E

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