人源化中介酶释放检测法：一种通过体外监测嗜碱性粒细胞脱颗粒反应来筛选待测抗原致敏潜能的免疫化学方法

摘要

来源：Wenger, M. 等. 以人源化介质释放实验评估过敏原效力。视频实验杂志 (2021)

在本视频中，我们描述了一种 体外 评估抗原诱导嗜碱性粒细胞脱颗粒的致敏潜能的方法。以β-己糖胺酶作为化学介质释放的指标，并使用荧光底物测定β-己糖胺酶的酶活性。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查

1. 人源化RBL细胞的被动致敏

1. 将预孵育的 Ag8/血清悬浮液在 250 × g 条件下离心 5 分钟。
2. 取 50 µL 离心后的 Ag8/血清悬浮液，加入含 huRBL 细胞的各孔中，注意不要扰动 Ag8 细胞沉淀。
   1. 设置无抗原对照孔，即致敏但未刺激的细胞（不添加抗原），用于指示底部信号平台/背景值。背景对照孔和最大裂解对照孔无需用血清致敏。在这些对照孔中加入 50 µL huRBL 培养基代替。
3. 盖上培养板盖，于 37 °C、5%–7% CO₂ 条件下过夜孵育。

2. 抗原刺激的脱颗粒及介质释放

1. 提前在1x Tyrode缓冲液（9.5 g/L Tyrode盐，0.1%牛血清白蛋白（BSA），0.5 g/L碳酸氢钠（NaHCO₃）溶于dH₂O中）中配制抗原稀释液。每孔需加入最终体积100 µL。
   注意： 并非所有来源于天然或重组表达的变应原在1x Tyrode缓冲液中均稳定。因此，在进行实验前，应先在1x Tyrode缓冲液中进行稳定性测试。或者，可将1x Tyrode缓冲液用重水（D₂O）稀释，以提高实验的信噪比。
2. 在反应管中对目标抗原进行8个梯度的1:10系列稀释，起始浓度为10 µg/mL或1 µg/mL的蛋白。
   注意： 始终需预先测试该稀释系列。或者，可根据需要调整稀释比例（如1:5、1:20或1:30），以覆盖完整的释放曲线。此外，起始浓度可根据具体实验设计进行调整。
3. 清洗接种于96孔板上的huRBL细胞时，先小心吸出含血清的细胞培养基，将板倒置并在吸水纸上轻拍，以去除残留液体。
4. 每孔加入200 µL 1x Tyrode缓冲液清洗细胞。所有孔均应以相同方式处理。
   注意： 加入洗涤液时应缓慢，避免扰动细胞。
5. 静置约30秒，共重复洗涤三次。
6. 最后一次加入洗涤液后，将液体保留在孔中，直至准备加入抗原稀释液。
   注意： 避免细胞暴露于空气中过久。
7. 向含有预致敏huRBL细胞的每孔中转移100 µL抗原溶液。
   注意： 若需同时分析多个不同参数，可先将稀释系列中的各份样品转移至另一块无吸附性96孔板中（布局应与huRBL板一致），随后使用多通道移液器直接将其转移至huRBL细胞板上。此方法可避免细胞长时间暴露于空气中，从而防止实验性能下降（信号降低或无信号）。
8. 向对照孔（最大裂解孔和非致敏背景孔）中加入100 µL 1x Tyrode缓冲液。这些对照孔不加入抗原刺激。
   1. 此外，在稀释系列中致敏但不加抗原的孔中也加入100 µL 1x Tyrode缓冲液，以便在数据分析时考虑致敏细胞的抗原非依赖性自发释放。
9. 将huRBL细胞在37 °C、5%-7% CO₂条件下孵育1小时。

3. 荧光法测定β-己糖胺酶活性

1. 向最大裂解对照孔中每孔加入 10 µL 的 10% Triton X-100，充分混匀，以彻底裂解细胞，实现 β-己糖胺酶的 100% 释放。
2. 向一个新的非结合性 96 孔板中每孔加入 50 µL 底物溶液。配制一整板底物溶液：5 mL 0.1 M 柠檬酸检测缓冲液（pH 4.5）和 80 µL 10 mM 4-甲基伞形基-N-乙酰-β-D-葡糖胺苷。
3. 将所有孔的 50 µL 细胞上清液转移至含有底物溶液的新板中。
   注意：从 huRBL 板中移取上清液时需小心操作，避免扰动 huRBL 细胞。
4. 将含底物溶液和细胞上清液的板在 37 °C 下孵育 1 小时，使荧光底物发生转化。
   注意：保留 huRBL 板用于细胞活力检测。
5. 每孔加入 100 µL 终止液（15 g/L 甘氨酸、11.7 g/L NaCl 溶于 dH₂O，pH 10.7）。
6. 使用酶标仪在 360 nm 激发波长和 465 nm 发射波长下测定荧光值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-甲基伞形基-N-乙酰-β-D-葡糖胺苷	Sigma	M2133
用于huRBL细胞的96孔板（Nunc MicroWell 96孔，Nunclon Delta表面处理，平底微孔板）	ThermoFisher Scientific	167008
用于底物溶液和细胞上清液的96孔板（Greiner BioOne未处理96孔微孔板）	Fisher Scientific	655101
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	10735078001
柠檬酸	Applichem	131018
甘氨酸	Applichem	A3707
氯化钠（NaCl）	Applichem	A2942
碳酸氢钠（NaHCO3）	Applichem	131638
吐温X-100	Sigma	X100
台氏盐（Tyrode’s salt）	Sigma	T2145