基于ATP的荧光素酶活力检测法：一种均相评估受试药物对肿瘤类器官生长抑制潜力的方法

摘要

来源：Higa, A. 等. 高通量 体外 使用患者来源肿瘤类器官的检测方法 J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们展示了一种快速、单次添加的检测方法，用于评估测试药物处理后患者来源类器官的细胞活力，该方法以细胞内ATP水平作为细胞代谢活性的指标。细胞内ATP水平通过荧光素酶/荧光素反应进行测定，所发射的光强度可反映细胞活力，进而指示测试药物的生长抑制效力。

方案

1. 生长抑制高通量筛选（HTS）

注意：通过测定患者来源的肿瘤类器官（PDO）细胞内三磷酸腺苷（ATP）含量，评估抗癌药物的生长抑制活性，如图1所示。该步骤使用市售的细胞活力检测试剂盒进行（参见材料表）。

1. 在第0天，将PDO（例如RLUN007）在培养瓶中进行培养，直至获得足够数量的细胞簇用于实验。接种前一天，将75 cm²培养瓶中的PDO悬液转移至15 mL离心管中，在200 x g条件下离心2分钟，以测定PDO沉淀体积。随后，将PDO沉淀重悬于15 mL新鲜培养基中，并转移回75 cm²培养瓶。于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。
   注意：PDO沉淀所需体积取决于每个PDO的扩增速率以及实验所用384孔板的数量。对于RLUN007，接种至十个384孔板需要200 µL的细胞沉淀体积。
2. 在第1天（换液后24小时），使用细胞破碎与分散设备（见材料表），配合装有70 µm孔径滤膜的滤器装置对PDO进行切碎处理。然后将15 mL PDO悬液稀释10倍。使用细胞悬液分配器（见材料表）将40 µL PDO悬液接种至384孔超低吸附球体（圆底）微孔板中（见材料表）。
   注意：为破碎细胞簇，建议使用市售的细胞破碎与分散设备（见材料表）。
3. 接种后24小时（第2天），使用液体处理系统（见材料表）向PDO加入0.04 µL测试剂溶液，终浓度范围为20 µM至1.0 nM（10倍系列稀释）。
4. 在第8天（给予测试物质处理后144小时），向检测孔中加入胞内ATP检测试剂。使用振荡器混匀微孔板，并在25 °C下孵育10分钟。使用酶标仪（见材料表）检测胞内ATP含量，以发光信号表示。
5. 为计算细胞活力，将测试孔中的ATP量除以溶剂对照孔中的ATP量（均扣除背景值）。为计算6天内的生长速率，将接种后24小时的溶剂对照孔ATP量作为分母，除以第8天的溶剂对照孔ATP量。
6. 使用生物数据分析软件（见材料表）根据剂量-反应曲线计算50%抑制浓度（IC₅₀）和曲线下面积（AUC）值。Z因子是一个无量纲参数，取值范围为1（无限分离）至<0，其定义为 Z = 1 - (3σc+ + 3σc−) / |µc+ − µc−|，其中σc+、σc−、µc+和µc−分别为高值对照（c+）和低值对照（c−）的标准差（σ）和平均值（µ）。

结果

图1： 使用384孔微孔板构建高通量检测系统的实验方案概要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
384孔超低吸附球体微孔板	Corning	4516	高通量筛选用板
癌细胞扩增培养基plus	Fujifilm Wako Pure Chemical	032-25745	F-PDO培养基
CellPet FT	JTEC	-	细胞破碎与分散设备
CellTiter-Glo 3D细胞活力检测	Promega	G9683	细胞活力发光检测法，细胞内ATP测定试剂
Echo 555	Labcyte	-	液体处理系统
EnSpire	PerkinElmer	-	微孔板读板仪
Morphit软件，版本6.0	The Edge Software Consultancy		生物数据分析软件
Multidrop Combi	ThermoFisher Scientific	5840300	细胞悬液分配器
RLUN007	Fujifilm Wako Pure Chemical 或 Summit Pharmaceuticals International		来源于肺肿瘤的F-PDO
超低吸附75 cm² 培养瓶	Corning	3814	类器官（PDO）培养用培养瓶