配体差异径向毛细管作用分析：一种高通量筛选细菌核苷酸第二信使结合蛋白的细胞内靶标蛋白技术

摘要

来源：Schicketanz, M. L.，等。利用配体差异径向毛细管作用分析法（DRaCALA）鉴定小分子配体的结合蛋白。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了配体检测的差分径向毛细管作用——一种用于系统性高通量筛选细胞内核苷酸第二信使结合蛋白的技术。该技术可实现第二信使直接与细胞裂解液中过表达的目标蛋白结合，从而无需进行蛋白质纯化。

方案

1. 全细胞裂解液的制备

1. 接种 E. coli 将K-12 ASKA ORFeome文库菌株接种于含25 µg/mL氯霉素的1.5 mL LB培养基中，置于96孔深孔板内。在30 °C、160 rpm振荡条件下过夜培养18小时。次日，向过夜培养物中加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度0.5 mM，在30 °C、160 rpm条件下继续诱导蛋白表达6小时。
2. 500 × 离心收集细胞 g 10分钟。将沉淀在-80 °C冷冻保存备用。裂解细胞时，加入150 µL裂解缓冲液L1（40 mM Tris pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl₂，加入2 mM苯基甲基磺酰氟（PMSF）、40 µg/mL DNase 1和0.5 mg/mL溶菌酶的溶液重悬沉淀。
3. 将细胞在 -80 °C 冻存 30 分钟，然后在 37 °C 解冻 20 分钟。重复此循环三次以裂解细胞。裂解物在使用前于 -80 °C 保存。

2. Rel_seq 和 GppA 的纯化

注意：使用来自马链球菌（Streptococcus equisimilis）的重组蛋白Rel_seq和来自大肠杆菌（E. coli）K-12的GppA分别合成放射性标记的pppGpp和ppGpp。

1. 培养并收集过表达每种蛋白的细胞。
   1. 在LB肉汤中将E. coli BL21 DE3菌株培养至对数生长期（光密度（OD）约为0.3–0.4），取1 mL培养物在6000 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，用100 µL冰预冷的TSB肉汤（LB肉汤中添加0.1 g/mL PEG3350、0.05 mL/mL二甲基亚砜和20 mM MgCl₂）重悬细胞。
   2. 将分别含有组氨酸标签的relseq和gppA质粒各100 ng加入上述TSB细胞悬液中，冰上孵育30分钟。在42 °C热激40秒。将混合物放回冰上2分钟，然后加入1 mL室温LB肉汤，在37 °C、160 rpm振荡条件下恢复培养1小时。
   3. 将恢复后的细胞涂布于添加相应抗生素的LB琼脂平板上（Rel_seq：100 µg/mL氨苄青霉素；GppA：30 µg/mL卡那霉素）。次日，挑取单菌落接种至LB肉汤中，于37 °C开始过夜预培养。
   4. 培养18小时后，取10 mL过夜培养物接种至500 mL LB培养基中，并加入相应的抗生素。在37 °C、160 rpm振荡条件下培养。当OD_600nm达到0.5–0.7时，加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达，在30 °C、160 rpm振荡条件下继续培养3小时。
   5. 在4 °C条件下以6084 × g离心10分钟收集细胞。用20 mL冰预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀，在4 °C条件下以1912 × g再次离心20分钟。弃去上清液，将沉淀于-20 °C冷冻保存备用。
2. 镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和纯化
   注意：从本步骤开始，确保所有样品保持低温。
   1. 加入40 mL冰预冷的裂解缓冲液L2（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，10 mM咪唑，10 mM β-巯基乙醇，并加入蛋白酶抑制剂（无EDTA片剂；参见材料表）重悬沉淀。通过超声处理裂解细胞（60%振幅，开2秒/关4秒，累计开启8分钟）。在4 °C条件下以23,426 × g离心40分钟澄清裂解液，取上清液进行后续纯化。
   2. 在上述离心过程中，准备Ni-NTA树脂。
      1. 将500 µL均质化的Ni-NTA树脂转移至直立的聚丙烯层析柱中，静置15分钟使储存液自然流出。用超纯水洗涤树脂两次，每次15 mL，然后用15 mL裂解缓冲液L2洗涤层析柱。
   3. 将步骤1中澄清的细胞裂解上清液上样至层析柱，使其自然流过。用30 mL洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，20 mM咪唑）洗涤层析柱。
   4. 用400 µL洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油，500 mM咪唑）洗脱蛋白三次，随后再用300 µL洗脱缓冲液重复洗脱一次。合并所有洗脱组分，最终体积为700 µL。
3. 凝胶过滤
   1. 配制凝胶过滤缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5；200 mM NaCl；5%甘油）。用一个柱体积（25 mL）的凝胶过滤缓冲液洗涤尺寸排阻层析柱。
   2. 使用500 µL进样环加载上述700 µL样品，流速设为0.5 mL/min，收集2–3个含有目标蛋白的组分，每管0.5 mL。
   3. 合并含有各目标蛋白的组分，使用离心浓缩柱进行浓缩，并通过Bradford法测定蛋白浓度。

3. ³²P标记的pppGpp和ppGpp的合成

1. 在螺口管中组装小规模的 Rel_seq 反应 （见表1）。
   注意： 放射性试剂操作仅可在取得许可的场所进行，并须佩戴个人防护装备。
2. 将试管置于37 °C的恒温混匀仪中孵育1小时，随后在95 °C孵育5分钟，再置于冰上5分钟。在15,700 × g 离心5分钟，沉淀蛋白，将上清液（合成的 ³²P-pppGpp）转移至新的螺口管中。
3. 为将 ³²P-pppGpp 转化为 ³²P-ppGpp，取一半的 ³²P-pppGpp 产物转移至新的螺口管中，加入1 µM GppA。将试管在37 °C孵育10分钟，95 °C孵育5分钟，然后置于冰上5分钟。
4. 在15,700 × g 离心5分钟，沉淀蛋白，将上清液（合成的 ³²P-ppGpp）转移至新的螺口管中。
5. 取1 µL样品，在薄层色谱板（聚乙烯亚胺修饰的纤维素TLC板）上进行薄层色谱分析，以1.5 M KH₂PO₄（pH 3.4）作为流动相，检测 ³²P-pppGpp 和 ³²P-ppGpp。
   注意： 使用α-³²P标记的鸟苷5'-三磷酸（³²P-α-GTP）作为对照。
6. 将TLC板完全干燥，夹在透明塑料文件夹之间，暴露于存储磷屏5分钟。使用磷屏成像仪对信号进行可视化和定量分析。
   注意： 当 ³²P-pppGpp 与 ³²P-ppGpp 的比例高于85%时，可参照 表1 组装并合成大规模反应（500 µL，足以用于20块96孔板的筛选）。

4. (p)ppGpp 靶蛋白的 DRaCALA 筛选

1. 将20 µL全细胞裂解液解冻并转移至96孔V型底微孔板中。每孔加入2.5 U来自Serratia marcescens的内切核酸酶，在37 °C孵育15分钟以降低裂解液黏度。将裂解液置于冰上20分钟。
2. 将³²P-pppGpp与³²P-ppGpp按1:1比例混合，加入1倍体积的裂解缓冲液L1，使(p)ppGpp的终浓度为4 nM。
   注意：由于pppGpp与ppGpp在化学结构上高度相似，同时使用两种化合物的混合物可简化筛选过程。
3. 使用多通道移液器和带滤芯的移液吸头，将10 µL (p)ppGpp混合物加入细胞裂解液中并混匀。室温（RT）孵育5分钟。
4. 将96针点样工具浸入0.01%非离子型去污剂溶液中清洗30秒，随后在纸巾上干燥30秒。重复清洗该点样工具3次。
5. 将点样工具插入上述96孔样品板中，静置30秒。垂直提起点样工具，再垂直将其压入硝酸纤维素膜上，保持30秒。
   注意：若出现斑点缺失，可用移液器配合带滤芯吸头点加2 µL相应样品。建议如图示所示，对同一样品进行重复点样以形成双份斑点。
6. 室温干燥膜5分钟。将膜夹在透明塑料文件夹之间，暴露于存储磷屏5分钟，使用磷光成像仪进行检测。

5. 潜在靶蛋白的定量与鉴定

1. 使用与磷屏成像仪配套的分析软件打开可视化平板的 .gel 文件。利用阵列分析功能，设置一个 12 列 × 8 行的网格，以定义 96 个斑点。
2. 定义大圆圈以包围整个斑点的外缘（见图 1）。导出所定义大圆圈的体积+背景和面积，并保存至电子表格中。
   注意：如有需要，可重新调整每个单独圆圈的位置，使其与斑点完全重叠，并调整每个圆圈的大小，使其略大于实际斑点。
3. 将已定义的圆圈缩小，以包围内部的小点。导出所定义小圆圈的体积+背景和面积，并保存至电子表格中。
4. 在电子表格中使用图 1中的公式计算结合分数，并绘制数据图。通过比较其他大多数孔的结合分数，识别出显示高结合分数孔中的潜在结合蛋白。

表1：³²P标记的pppGpp小规模与大规模合成反应的组装信息。 *10× Relseq缓冲液包含250 mM Tris-HCl，pH 8.6；1 M NaCl；80 mM MgCl₂。缩写：pppGpp = 鸟苷五磷酸。

	体积 (μL)
	小规模	大规模
超纯水
10x Relseq 缓冲液*	2	50
ATP（终浓度 8 mM）
Relseq（终浓度 4 μM）
32P-α-鸟苷三磷酸（GTP）（终浓度 120 nM）（注意）	0.2	5
总计	20	500

结果

图1：结合分数的定量与计算。 详见正文。简而言之，将通过绘制两个圆圈来分析 DRaCALA 斑点，分别包围整个斑点及内部的深色小点即，由于被测蛋白质结合而保留的 (p)ppGpp)。特异性结合信号是内圈的放射性信号（S₁) 在减去非特异性背景信号后（通过 A 计算得出）₁ × ((S₂- S₁)/(A₂- A₁))). 结合分数为特异性结合信号除以...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<sup>32</sup>P-&alpha;-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 孔针工具	V&amp;P Scientific	VP 404	96 孔螺栓复制器，中心间距 9 mm，螺栓直径 4.2 mm，长度 24 mm
96 孔 V 型底微孔板	Sterilin	MIC9004	Sterilin 微孔板 V 型孔 611V96
琼脂	OXOID - 赛默飞世尔科技	LP0011	1 号琼脂
ASKA 文库菌株	NBRP, SHIGEN, 日本		参考文献：DNA Research，第 12 卷，第 5 期，2005 年，第 291&ndash;299 页。https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
苯并核酸酶	SIGMA	E1014-25KU	来自粘质沙雷氏菌的基因工程核酸内切酶
Bradford 蛋白检测试剂	伯乐	5000006	试剂浓缩液
DMSO	SIGMA	D8418	&ge;99.9%
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
凝胶过滤柱（10x300）	GE Healthcare	28990944	含 20% 乙醇作为防腐剂
甘油	PanReac AppliChem	122329.1214	分析纯 87% 甘油
HyperCassette	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
咪唑	SIGMA	56750	特纯 p.a.，&ge; 99.5%（GC）
IP 储存磷屏	富士胶片	28956474	BAS-MS 2040 20 x 40 cm
异丙基 &beta;-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	SIGMA	I6758	异丙基 &beta;-D-硫代半乳糖苷
溶菌肉汤（LB）	英韦特罗根 - 赛默飞世尔科技	12795027	Miller's LB 肉汤基础
溶菌酶	SIGMA	L4949	来源于鸡蛋清；BioUltra，冻干粉末，&ge;98%
&nbsp;MgCl<sub>2</sub>（氯化镁）	SIGMA	208337
MilliQ 水			超纯水
多通道移液器	赛默飞世尔科技	4661110	F1 - Clip Tip；1-10 μl，8 通道
NaCl	VWR Chemicals	27810	AnalaR NORMAPUR，ACS，Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA 琼脂糖	Qiagen	30230
硝酸纤维素印迹膜	Amersham Protran	10600003	优质 0.45 μm 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - 赛默飞世尔科技	BR0014G	磷酸盐缓冲液（Dulbecco A），片剂
PEG3350（聚乙二醇 3350）	SIGMA	202444
苯甲基磺酰氟（PMSF）	SIGMA	93482	苯甲基磺酰氟溶液 - 0.1 M 乙醇溶液（T）
磷屏成像仪	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 磷屏成像仪
带滤芯移液器吸头	赛默飞世尔科技	94410040	ClipTip 12.5 &mu;l 非无菌
Poly-Prep 层析柱	伯乐	7311550	聚丙烯层析柱
蛋白酶抑制剂小片剂	Pierce	A32955	片剂，无 EDTA
螺旋盖离心管	赛默飞世尔科技	3488	微量离心管，2.0 ml 带螺旋盖，非无菌
SLS 96 孔深孔板	Greiner	780285	MASTERBLOCK，2 ml，聚丙烯，V 型底，透明
离心柱	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0.5 ml 离心过滤器
恒温混匀仪	艾本多夫	5382000015	Thermomixer C
TLC 板（PEI-纤维素 F TLC 板）	默克密理博	105579	DC PEI-纤维素 F（20 x 20 cm）
Tris	SIGMA	BP152	分子生物学用 Tris 碱
Tween 20	SIGMA	P1379	粘稠非离子型去污剂
&beta;-巯基乙醇	SIGMA	M3148	99%（GC/滴定）