配体测定的差异径向毛细作用:一种鉴定细菌核苷酸第二信使结合细胞内蛋白的高通量技术

1. 全细胞裂解物的制备

1. 将大肠杆菌 K-12 ASKA ORFeome 收集菌株接种到 96 孔深孔板中含有 25 μg/mL 氯霉素的 1.5 mL 溶原肉汤 （LB） 中。在 30 °C 下生长过夜 （O/N） 18 小时，并以 160 rpm 振荡。第二天，向O / N培养物中加入异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（最终0.5mM），以在30°C下诱导蛋白质表达6小时。
2. 以 500 x g 的离心沉淀细胞 10 分钟。将沉淀物在 -80 °C 下冷冻直至使用。要裂解细胞，加入 150 μL 裂解缓冲液 L1（40 mM Tris pH 7.5、100 mM NaCl、10 mM MgCl₂，补充有 2 mM 苯甲基磺酰氟 （PMSF）、40 μg/mL DNase 1 和 0.5 mg/mL 溶菌酶）以重悬沉淀。
3. 将细胞在 -80 °C 下冷冻 30 分钟，然后在 37 °C 下解冻 20 分钟。重复此循环 3 次以裂解细胞。使用前将裂解物储存在 -80 °C。

2. Rel_seq 和 GppA 的纯化

>注:来自马链球菌的重组蛋白 Rel_seq 和来自大肠杆菌 K-12 的 GppA 分别用于合成放射性标记的 pppGpp 和 ppGpp。

1. 生长和收集过表达每种蛋白质的细胞。
   1. 在 LB 肉汤中将大肠杆菌 BL21 DE3 菌株培养至指数期（光密度 （OD） ~0.3-0.4），并以 6000 x g 的速度离心 1 mL 培养物 5 分钟。倒出上清液，并用 100 μL 冰冷的 TSB 肉汤（补充有 0.1 g/mL PEG3350、0.05 mL/mL 二甲基亚砜的 LB 肉汤、 20 毫米氯化镁₂）。
   2. 将带有组氨酸标记的 relseq 和 gppA 的质粒（各 100 ng）与上述细胞悬液在 TSB 中混合，并在冰上孵育 30 分钟。在 42 °C 下热休克细胞 40 秒。将混合物放在冰上 2 分钟，并在室温下加入 1 mL LB 肉汤，让细胞在 37 °C 下以 160 rpm 搅拌恢复 1 小时。
   3. 将回收的细胞接种在补充有相应抗生素的 LB 琼脂平板上（Rel_seq:100 μg/mL 氨苄青霉素;GppA:30 μg/mL 卡那霉素）。第二天，将菌落接种在 LB 肉汤中，以在 37 °C 下开始两种菌株的 O/N 预培养。
   4. 18 小时后，用 10 mL O/N 培养物和相应的抗生素接种 500 mL LB 培养基。通过在 37 °C 下以 160 rpm 振荡来培养培养物。当 OD_600nm 达到 0.5-0.7 时，通过添加 0.5 mM IPTG 并在 30 °C 下以 160 rpm 振荡生长 3 小时来诱导蛋白质表达。
   5. 通过在 4 °C 下以 6084 x g 旋转 10 分钟来收集细胞。将沉淀重悬于 20 mL 冰冷的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，并在 4 °C 下以 1912 x g 重新离心 20 分钟。倒出上清液，并在使用前将沉淀在 -20 °C 下冷冻。
2. 次氮基三乙酸镍 （Ni-NTA） 亲和纯化
   注意:从这时起，确保样品是冷的。
   1. 加入 40 mL 冰冷裂解缓冲液 L2（50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、5% 甘油、10 mM 咪唑、10 mM β-巯基乙醇）补充蛋白酶抑制剂（不含 EDTA 的片剂;参见材料表）以重悬沉淀。通过超声处理裂解细胞（60% 振幅，2 秒开/4 秒关，持续 8 分钟）。通过在 4 °C 下以 23,426 x g 旋转 40 分钟来澄清裂解物，然后继续用上清液进行纯化。
   2. 在上述离心过程中，制备 Ni-NTA 填料。
      1. 将 500 μL 匀浆的 Ni-NTA 树脂转移到立式聚丙烯色谱柱中，静置 15 分钟，储存溶液排出。用 15 mL 超纯水洗涤树脂两次，然后用 15 mL 裂解缓冲液 L2 洗涤色谱柱。
   3. 将步骤 1 中澄清的细胞裂解物上清液加载到色谱柱上，并让它流过。用 30 mL 洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、5% 甘油、20 mM 咪唑）洗涤色谱柱。
   4. 用 400 μL 洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、5% 甘油、500 mM 咪唑）洗脱蛋白质 3 次。然后，用另外 300 μL 洗脱缓冲液重复洗脱。将洗脱的蛋白质混合至最终体积为 700 μL。
3. 凝胶过滤
   1. 制备凝胶过滤缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5;200 mM NaCl;5% 甘油）。用 1 倍柱体积 （25 mL） 的凝胶过滤缓冲液洗涤体积排阻柱。
   2. 使用 500 μL 定量环加载上述 700 μL 样品，以 0.5 mL/min 的速度运行，并收集 2-3 个馏分，每个馏分的体积为 0.5 mL，含有相应的蛋白质。
   3. 使用离心柱合并并浓缩含有每种蛋白质的级分，并使用 Bradford 测定法测量蛋白质浓度。

3. ³²个 P 标记的 pppGpp 和 ppGpp 的合成

1. 在螺帽管中组装小规模的 Rel_seq 反应（见表 1）.
   注意:仅在有许可的场所使用放射性试剂，并配备个人防护设备。
2. 将试管在 37 °C 下在热混合器中孵育 1 小时，然后在 95 °C 下孵育 5 分钟，并置于冰上 5 分钟。将沉淀的蛋白质以 15,700 x g 离心 5 分钟，并将上清液（合成的 ³²P-pppGpp）转移到新的螺帽管中。
3. 要从 ³²P-pppGpp 合成 ³²P-ppGpp，将 ³²P-pppGpp 产物的一半转移到新的螺帽管中，并加入 1 μM GppA。将试管在 37 °C 下孵育 10 分钟，在 95 °C 下孵育 5 分钟，然后置于冰上 5 分钟。
4. 将沉淀的蛋白质以 15,700 x g 离心 5 分钟，然后将上清液（合成的 ³²P-ppGpp）转移到新的螺旋盖管中。
5. 使用 1.5 M KH₂PO_4，pH 3.4 作为流动相，在薄层色谱 （TLC） 板（聚乙烯亚胺改性纤维素 TLC 板）上运行 1 μL 样品，分析 ³²P-pppGpp 和 ³²P-ppGpp><。 注意:使用 ^α-32P 标记的鸟苷 5'-三磷酸 （³²P-α-GTP） 作为对照。
6. 将 TLC 板完全干燥，将其放在透明塑料文件夹之间，并将其暴露在存储荧光屏下 5 分钟。使用磷光成像仪可视化和量化信号。
   注意:当 ³²P-pppGpp 和 ³²P-ppGpp 的比例高于 85% 时，可以使用表 1 组装和合成大规模反应 （500 μL，足以筛选 20 个 96 孔板）。

4. DRaCALA 筛选 （p）ppGpp 的靶蛋白

1. 解冻并将 20 μL 全细胞裂解物转移到 96 孔 V 形底微量滴定板中。加入 2.5 U/孔的来自粘质沙雷氏菌的核酸内切酶，并在 37 °C 下孵育 15 分钟以降低裂解物粘度。将裂解物置于冰上 20 分钟。
以
2. 1:1 的比例混合 ³²个 P-pppGpp 和 ³²个 P-ppGpp，并加入 1x 裂解缓冲液 L1，使 （p）ppGpp 的最终浓度等于 4 nM.
   注意:鉴于 pppGpp 和 ppGpp 之间的化学相似性，两种化学品的混合物将简化筛选过程。
3. 使用多通道移液器和过滤的移液器吸头添加 10 μL （p）ppGpp 混合物并将其与细胞裂解物混合。在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。
4. 将 96 x pin 工具置于 0.01% 非离子洗涤剂溶液中 30 秒，然后在薄纸上干燥 30 秒。重复 pin 工具的洗涤 3 次。
5. 将针工具放在上述 96 孔样品板中，等待 30 秒。将针工具笔直向上提起，然后将其笔直向下放在硝酸纤维素膜上 30 秒
   注意:如果缺少斑点，则用移液管和过滤吸头点样 2 μL 的相应样品。建议对同一样品进行复制，如下所示。
将
6. 膜在 RT 下干燥 5 分钟。将膜放在透明塑料文件夹之间，并将其暴露在存储荧光屏下 5 分钟。使用磷光成像仪进行可视化。

5. 潜在靶蛋白的定量和鉴定

1. 使用与磷光成像仪相关的分析软件打开可视化板的 .gel 文件。使用数组分析功能，通过设置 12 列 x 8 行的网格来定义 96 个点。
2. 定义大圆圈以包围整个光斑的外边缘（参见图 1）。导出已定义大圆圈的 Volumn+Background 和 Area，并保存在电子表格中。
   注意:如果需要，重新定位每个单独的圆圈以与点完美重叠，并调整每个单独的圆圈的大小以使其略大于实际点。
3. 缩小定义的圆圈的大小以限定小的内点。导出已定义小圆圈的 Volumn + Background 和 Area，并保存在电子表格中。
4. 使用图 1 中的方程计算电子表格中的结合分数，并绘制数据。鉴定孔中的潜在结合蛋白，与大多数其他孔相比，这些结合蛋白显示出高结合分数。

表 1:³²个 P 标记的 pppGpp 的小规模和大规模合成反应的组装信息。*10x Relseq 缓冲液含有 250 mM Tris-HCl，pH 值 8.6;1M NaCl;80 mM MgCl₂.缩写:pppGpp = 鸟苷五磷酸。

图 1:结合级分的定量和计算。有关详细信息，请参阅文本。简而言之，DRaCALA 斑点将通过绘制两个圆圈来分析，这两个圆圈环绕整个斑点和内部黑点（即，由于测试蛋白质的结合而保留的 （p）ppGpp）。特异性结合信号是内圈 （S1） 减去非特异性背景信号（以 A1 × （（S2-S 1）/（A2-A 1））） 计算）后的放射性信号。结合分数是特异性结合信号除以总放射性信号 （S2）。缩写:DRaCALA = 配体测定的差异径向毛细作用;（p）ppGpp = 鸟苷五磷酸盐和四磷酸盐;RT = 室温。