荧光探针成像检测：一种用于可视化活性氧诱导剂处理的培养肠类器官细胞中氧化应激的技术

摘要

来源：Stedman, A. 等，利用活性氧敏感性荧光探针分析小鼠肠道类器官中的氧化应激。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频介绍了在培养的类器官中可视化氧化应激的技术。该研究有助于理解在使用不同活性氧调节剂处理后，类器官中各类细胞因活性氧（ROS）积累所导致的氧化应激水平。

方案

1. 通过共聚焦显微镜观察三维类器官中的氧化应激

1. 取接种于 µ-Slide 8 孔板中的类器官，在相应孔中加入 1 µL N-乙酰半胱氨酸（NAC）储备液，使终浓度为 1 mM。
2. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时。
3. 在相应孔中加入 1 µL tBHP 储备液，使终浓度为 200 µM。
4. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
5. 每孔加入 1 µL 氟原探针的 1.25 mM 稀释液，使终浓度为 5 µM。
6. 每孔加入 1 µL Hoechst 的 1.25 mg/mL 稀释液，使终浓度为 5 µg/mL。
7. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
8. 移除培养基，注意不要扰动基底膜基质（BMM）。轻柔地加入 250 µL 预热的无酚红 DMEM。
   注意：若计划进行长时间成像，应在无酚红 DMEM 中添加生长因子类化合物。
9. 使用配备温控腔室和气体供应系统的共聚焦显微镜对类器官进行成像，检测氟原探针（ROS）信号。
   注意：氟原探针的激发/发射波长（ex/em）为 644/665，Hoechst（细胞核）为 361/486，GFP（来自 Lgr5-GFP 小鼠的肠干细胞）为 488/510。检测干细胞信号时使用 63 倍油浸物镜。不同样本之间不得更改激光设置。可使用 20 倍物镜以获得 ROS 生成的整体视图。
10. 使用阳性对照设定 ROS 信号的激光强度和曝光时间，并确认该信号在阴性对照中较低。
11. 通过目镜观察载玻片，筛选表达 GFP 的类器官，并 调整激光强度。
    注意：此步骤需手动完成。
12. 设定成像位置，以获得整个类器官的拼接图像。设置 z 轴层扫为 25 µm（步长 5 µm），以获取显示单层细胞的类器官切片。
    注意：请参考显微镜用户手册以优化设置。对于活细胞，应在孵育结束后 1 小时内完成图像采集。
13. 在开源图像处理软件中打开图像（见 材料表）。
14. 浏览 z 轴层扫图像，选择类器官中部结构清晰的层面，并基于选定区域创建新图像。
15. 按照以下步骤对图像进行定量分析：
    1. 选择自由手绘线工具。
    2. 沿细胞核轮廓绘制线条。
       注意：若仅分析干细胞，应仅选择含有 GFP 阳性细胞的区域。
    3. 增加线宽，使线条覆盖整个细胞层，但避免包含管腔内的碎片。
    4. 选择 ROS 信号通道，测量所选区域的荧光强度，并记录数值。
    5. 在无信号区域绘制线条，测量背景荧光强度，并将该值从先前测得的数值中扣除，以获得最终的荧光强度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)	The Jackson Laboratory
生长培养基
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
青霉素-链霉素 (P/S)	ThermoFisher	15140122	储存浓度：100倍（青霉素10,000 单位/mL，链霉素10,000 µg/mL）
FluoroBrite DMEM（无酚红DMEM）	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	储存浓度：10 mg/mL
Matrigel 生长因子减量、无酚红（基底膜基质）	Corning	356231	收到后在冰箱中过夜解冻，置于冰上1小时，分装为500 µL等份，储存于-20 °C
µ-Slide 8孔板	Ibidi	80826
N-乙酰半胱氨酸 (NAC)	Sigma	A9165
叔丁基过氧化氢 (tBHP) 溶液（70% wt. in H2O2）	Sigma	458139
软件与设备
Fiji/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ 下载图像生成软件
Observer.Z1	Zeiss		共聚焦系统
Opterra（扫描场共聚焦）	Bruker		共聚焦系统
高速EMCCD相机 Evolve Delta 512	Photometrics		共聚焦系统
Prism	GraphPad Software		统计分析