利用流式细胞术定量检测氧化应激：基于荧光探针定量肠道类器官中活性氧的检测方法

摘要

来源：Stedman, A.，等，利用活性氧敏感性荧光探针分析小鼠肠道类器官中的氧化应激。J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种流式细胞术检测方法，用于定量来自表达GFP的转基因小鼠的三维肠道类器官中的活性氧（ROS）水平。该方法提供了一种 体外 用于研究受试化合物对活性氧生成作用效果的实验模型。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 肠道类器官培养所需试剂与材料的准备

1. 配制生长培养基：将高级DMEM/F-12培养基与1x谷氨酰胺、1x青霉素/链霉素（P/S）溶液、10 mM HEPES、50 ng/mL小鼠EGF、20 µg/mL小鼠Noggin和500 ng/mL小鼠R-Spondin1混合（参见材料表）。在隐窝提取过程中，将培养基置于室温（RT）下备用。
   注意：未使用的培养基分装后于-20 °C冷冻保存，避免反复冻融。
2. 取一个50 mL离心管，加入40 mL高级DMEM/F-12培养基，并置于冰上保存。
   注意：未使用的培养基应保存在4 °C，用于类器官传代。
3. 将细胞培养板（96孔圆底板）放入37 °C培养箱中预热。
4. 将基底膜基质（BMM）（参见材料表）分装样品置于冰上解冻（在开始实验前或至少在接种隐窝前1小时进行）。
   注意：若未保持低温，BMM会迅速凝固。
5. 通过向DPBS中加入1%青霉素-链霉素溶液，配制洗涤/灌注溶液（DPBS-P/S）。
6. 在100 mm培养皿中加入10 mL冷的DPBS-P/S。另取六个15 mL离心管，每管加入10 mL DPBS，并标记为F1至F6。
7. 用DPBS将0.5 M EDTA溶液稀释，配制30 mL 10 mM EDTA溶液。取两个15 mL离心管，每管加入10 mL 10 mM EDTA溶液，并标记为E1和E2。
8. 所有溶液均需预先冷却至4 °C，并在操作过程中始终置于冰上。

2. 肠道类器官培养

1. 根据国家法规，处死一只8-10周龄的Lgr5-EGFP-IRES-creERT2（Lgr5-GFP）小鼠。
2. 采集空肠段5-8 cm，该区域位于十二指肠（距胃5 cm）与回肠（距盲肠10 cm）之间，并将其置于含冷DPBS-P/S的冰上保存。
3. 用5-10 mL冷DPBS-P/S冲洗以清除肠内容物。
   注意：可使用自制冲洗注射器，方法是将200 µL吸头插入10 mL注射器喷嘴中制成。
4. 使用圆头剪刀纵向剖开肠管（参见材料表），以避免组织损伤。
5. 用镊子将组织转移至含有冷DPBS-P/S的培养皿中，在室温下轻轻振荡清洗。
6. 用塑料巴斯德吸管通过负压吸取肠段，转移至标记为E1、含10 mL冷10 mM EDTA的15 mL离心管中。
7. 将离心管轻柔颠倒3次，冰上孵育10分钟。
8. 用塑料巴斯德吸管将组织转移至含10 mL DPBS的F1管中，涡旋振荡2分钟（使用普通涡旋仪，手动握住离心管，确保肠段充分旋转）。
9. 取10 µL该组分置于培养皿中，在显微镜下评估其质量。
   注意：所有涡旋步骤均以最大速度进行，每次分离后的组分均需在显微镜下评估质量（图1）。
10. 用塑料巴斯德吸管通过负压吸取肠段，转移至含10 mL DPBS的F2管中，涡旋振荡2分钟。
11. 重复步骤2.10，将组织转移至含10 mL DPBS的F3管中，涡旋振荡2分钟。
12. 重复步骤2.6的EDTA孵育过程，将组织转移至含10 mM EDTA的E2管中。
13. 将离心管轻柔颠倒3次，冰上孵育5分钟。
14. 重复步骤2.10，将组织转移至含10 mL DPBS的F4管中，涡旋振荡3分钟。
15. 重复步骤2.14，将组织转移至含10 mL DPBS的F5管中，涡旋振荡3分钟。
16. 重复步骤2.15，将组织转移至含10 mL DPBS的F6管中，涡旋振荡3分钟。
17. 将质量最佳的组分通过70 µm细胞筛自然重力过滤至50 mL离心管（置于冰上），以去除绒毛及较大碎片。
    注意：通常F5和F6组分含有较多隐窝且碎片较少。
18. 在4 °C下以150 × g离心3分钟收集隐窝。
19. 弃去上清液，机械性吹打重悬沉淀，加入5 mL冷DMEM/F12培养基。
20. 取10 µL悬液置于培养皿中，在显微镜下人工计数该分样中隐窝的数量。
    注意：不计数单个细胞或微小碎片。
21. 计算所需隐窝悬液的体积（V，单位为µL），其中每孔接种300个隐窝，W为孔数，N为10 µL悬液中计得的隐窝数。将隐窝转移至新的15 mL离心管中。
    注意：V = 300 × W × 10/N。若实验所需体积较小，可使用1.5 mL离心管。
22. 在4 °C下以200 × g离心3分钟收集隐窝。
23. 用移液器小心吸除上清液。
24. 机械性吹打重悬沉淀，轻柔加入生长培养基，使隐窝浓度达到90个/µL。
25. 加入2倍体积未稀释的BMM，使最终浓度为30个隐窝/µL。轻柔吹打混匀，避免引入气泡。
    注意：始终将离心管置于冰上，防止BMM凝固。
26. 将10 µL隐窝/BMM混合液接种至各孔中。用于流式细胞术分析时，使用圆底96孔板。将10 µL混合液以穹顶状置于每孔中央。
    注意：进行成像实验时，应将类器官以薄层形式接种，以便实现深层成像。
27. 将培养板在室温下静置5分钟，使BMM凝固。随后将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育15分钟。
28. 向每孔中加入250 µL生长培养基，注意避免破坏BMM凝胶。
29. 将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中继续培养。
30. 在培养第4至6天之间进行ROS分析。否则，当出现多个长出芽结构且类器官腔内积累死亡细胞时，更换培养基并传代类器官。

3. 类器官传代

1. 从小肠类器官的第6代开始进行传代^th 培养第几天，当出现明显的出芽结构且类器官的管腔变暗时。
   注意： 类器官腔内会因死亡细胞、碎片和黏液的积聚而变暗。传代前应避免类器官过度生长。传代比例取决于类器官的生长状况，建议在第6天以1:2的比例传代，第10天以1:3的比例传代。
2. 将4 mL冷的Advanced DMEM/F-12加入15 mL离心管中，并置于冰上保存。
   注意： 此处提供的是96孔培养板的体积。若使用其他规格的培养板，请相应调整体积。
3. 用移液管或真空泵小心吸去孔中的培养基，避免接触BMM穹顶，然后弃去。
4. 每孔加入 100 µL 冷的 Advanced DMEM/F-12。用移液器吹打数次以破碎骨髓来源的巨噬细胞（BMM），并将孔内液体转移至 15 mL 离心管中。
5. 用 200 µL 冷的 Advanced DMEM/F-12 洗涤孔板，并将洗液收集至同一离心管中。
   注意： 若对同一实验条件下多个孔中的细胞进行传代，可将各孔内容物汇集至同一支15 mL收集管中。
6. 将15 mL收集管以100 x g离心 g 4°C 下离心 5 分钟。
7. 弃去上清液，向沉淀中加入1 mL冷的Advanced DMEM/F-12培养基。使用P1000枪头吸取一个无滤芯的P10枪头，上下吹打至少20次。
8. 加入4 mL冷的Advanced DMEM/F-12至离心管中。以300 x g 4°C 下 5 分钟
9. 用移液器或真空泵吸去上清液，注意不要扰动沉淀。然后，通过机械方式将沉淀打散。
10. 加入用生长培养基稀释的BMM（2:1比例）。轻轻吹打混匀，避免在混合物中引入气泡。
11. 将 10 µL 隐窝/BMM 混合物接种至每个孔中。
12. 室温放置5分钟，使BMM凝固。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。₂ 15 分钟。
13. 向每个孔中加入 250 µL 培养基。
    注意： 注意不要使BMM脱落。
14. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中₂.

4. 肠类器官中氧化应激评估所用试剂与材料的制备

1. 配制250 mM的抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）储备液（参见材料表），将10 mg NAC溶于245 µL DPBS中。使用时终浓度为1 mM。
2. 配制50 mM的诱导剂叔丁基过氧化氢（tBHP，70%水溶液）储备液，取3.22 µL用496.8 µL DPBS稀释。使用时终浓度为200 µM。
3. 对于流式细胞术实验，将荧光探针的储备液用DMSO按1:10稀释，配制成250 µM的工作液（参见材料表）。使用时终浓度为1 µM。
   注意： 根据生产商说明书，该荧光探针对光和氧气敏感。储备液和分装样品应避免反复开闭。
4. 配制终浓度为0.1 µg/mL的DAPI DPBS溶液，用于流式细胞术检测中区分死细胞。
   注意： 上述步骤描述了实验中必须设置的阴性对照和阳性对照，条件如图2A所示。该实验可用于检测抗氧化或促氧化化合物。实验步骤相同，唯一区别在于测试化合物是在加入荧光探针之前添加。

5. 使用流式细胞仪定量分析解离类器官中的氧化应激水平

1. 在阴性对照孔中加入 1 µL NAC 储存液，使终浓度为 1 mM。
   注意：使用接种于 96 孔圆底培养板中的类器官。
2. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 1 小时。
3. 在相应孔中加入 1 µL tBHP 储存液，使终浓度为 200 µM。
4. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
5. 使用多通道移液器小心移除培养基，避免扰动贴壁的 BMM，并将其转移至另一块 96 孔圆底培养板中。将该培养板暂置一旁。
6. 加入 100 µL 胰蛋白酶溶液，使用多通道移液器反复吹打至少五次，以破坏 BMM 结构。
7. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育不超过 5 分钟。
8. 使用多通道移液器反复吹打至少五次，以解离类器官。
9. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
10. 通过倒置培养板弃去上清液。将第 6.3 步中收集的培养基重新加回到相应孔中，并通过上下吹打 5 次重悬细胞。
11. 加入终浓度为 1 µM 的荧光探针。每孔加入 1 µL 来自 250 µM 稀释液的探针，然后在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟。
    注意：不要向用于仪器设置的孔（图 2B）中添加荧光探针。
12. 在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
13. 用 250 µL 浓度为 0.1 µg/mL 的 DAPI 溶液重悬细胞。将样品转移至相应的流式细胞仪检测管中，将检测管置于冰上，并立即进行分析。
    注意：向用于仪器设置的孔（图 2B）中加入 PBS 代替 DAPI。
14. 使用单染样品优化未染色对照的前向散射和侧向散射电压设置，以及每种荧光染料的激光电压。
15. 采用适当的设门策略（图 3A），至少采集 20,000 个事件。
    注意：推荐采集 50,000 个事件。具体采集参数根据所用仪器的不同而有所调整。

结果

图1：隐窝与类器官的代表性图像。 (A) 第一次EDTA孵育后获得的F1组分示例，富含绒毛（方框），含少量碎片（星号）和隐窝（圆圈）。B) 富含隐窝的组分F4示例。 (C) 经70 µm细胞滤筛过滤后获得的仅含孤立隐窝的悬液（比例尺，200 µm）。(D, E、F分别在将隐窝嵌入BMM后第1、3和5天获得典型的类器官（比例尺，100...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>小鼠</strong>
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2（Lgr5-GFP）	杰克逊实验室
<强>生长培养基</strong>
高级DMEM F12（DMEM/F12）	赛默飞世尔科技	12634010
B-27 补充剂，不含维生素 A	赛默飞世尔科技	12587010	储存浓度：50x
GlutaMAX（谷氨酰胺）	ThermoFisher	35050038	储存浓度：100倍
Hepes	赛默飞世尔科技	15630056	储存浓度：1 M
小鼠EGF	R&amp;D	2028-EG-200	储存浓度：500 &micro;g/mL 在 PBS 中
小鼠Noggin	R&amp;D	1967-NG/CF	储存浓度：100 &micro;g/mL 在 PBS 中
小鼠 R-spondin1	R&amp;D	3474-RS-050	储存浓度：50 &micro;g/mL 在 PBS 中
N-2 补充剂	赛默飞世尔科技	17502048	储存浓度：100倍
青霉素-链霉素（P/S）	赛默飞世尔科技	15140122	储存浓度：100倍浓缩液（每毫升含10,000单位青霉素和10,000 &micro;g/mL 的链霉素
<强>材料</strong>
70 &micro;m细胞滤筛	康宁	352350
96孔圆底板	康宁	3799
球头剪	Fine Science Tools GMBH	14086-09
CellROX&reg; 深红色试剂	赛默飞世尔科技	C10422
DAPI（4&rsquo;,6-二脒基-2-苯并咪唑酮&eacute;尼吲哚二盐酸盐（荧光探针）	ThermoFisher	D1306	10 mg/mL 的储备液
不含钙不含镁的1×DPBS缓冲液（DPBS）	赛默飞世尔科技	14190144
基底膜基质（无酚红、生长因子减少型 Matrigel）	康宁	356231	收到后在冰箱中过夜解冻，置于冰上1小时，分装成500 mL等份，于-20 °C保存 &deg;C
N-乙酰半胱氨酸（NAC）	Sigma	A9165
过氧化叔丁基（tBCHP）溶液（70% wt.，以 H2O2 计）	Sigma	458139
TrypLE Express 酶（1X），无酚红（胰蛋白酶）	赛默飞世尔科技	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	赛默飞世尔科技	15575020
Y-27632	Sigma	Y0503	用于组织解离过程中减少细胞死亡的ROCK抑制剂
<强>项目与设备</strong>
Attune NxT（流式细胞仪）	ThermoFischer		流式细胞仪分析仪
FlowJo	BD生物科学		FACS 分析
Prism	GraphPad Software		统计分析