来源：Stedman, A.，等，利用活性氧敏感性荧光探针分析小鼠肠道类器官中的氧化应激。J. Vis. Exp. (2021)。
本视频展示了一种流式细胞术检测方法，用于定量来自表达GFP的转基因小鼠的三维肠道类器官中的活性氧（ROS）水平。该方法提供了一种 体外 用于研究受试化合物对活性氧生成作用效果的实验模型。
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方法文章
利用流式细胞术定量检测氧化应激：基于荧光探针定量肠道类器官中活性氧的检测方法
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 肠道类器官培养所需试剂与材料的准备
- 配制生长培养基：将高级DMEM/F-12培养基与1x谷氨酰胺、1x青霉素/链霉素（P/S）溶液、10 mM HEPES、50 ng/mL小鼠EGF、20 µg/mL小鼠Noggin和500 ng/mL小鼠R-Spondin1混合（参见材料表）。在隐窝提取过程中，将培养基置于室温（RT）下备用。
注意：未使用的培养基分装后于-20 °C冷冻保存，避免反复冻融。 - 取一个50 mL离心管，加入40 mL高级DMEM/F-12培养基，并置于冰上保存。
注意：未使用的培养基应保存在4 °C，用于类器官传代。 - 将细胞培养板（96孔圆底板）放入37 °C培养箱中预热。
- 将基底膜基质（BMM）（参见材料表）分装样品置于冰上解冻（在开始实验前或至少在接种隐窝前1小时进行）。
注意：若未保持低温，BMM会迅速凝固。 - 通过向DPBS中加入1%青霉素-链霉素溶液，配制洗涤/灌注溶液（DPBS-P/S）。
- 在100 mm培养皿中加入10 ....
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结果
图1：隐窝与类器官的代表性图像。 (A) 第一次EDTA孵育后获得的F1组分示例，富含绒毛（方框），含少量碎片（星号）和隐窝（圆圈）。B) 富含隐窝的组分F4示例。 (C) 经70 µm细胞滤筛过滤后获得的仅含孤立隐窝的悬液（比例尺，200 µm）。(D, E、F分别在将隐窝嵌入BMM后第1、3和5天获得典型的类器官（比例尺，100.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>小鼠</strong> | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2（Lgr5-GFP） | 杰克逊实验室 | ||
| <强>生长培养基</strong> | |||
| 高级DMEM F12（DMEM/F12） | 赛默飞世尔科技 | 12634010 | |
| B-27 补充剂，不含维生素 A | 赛默飞世尔科技 | 12587010 | 储存浓度：50x |
| GlutaMAX（谷氨酰胺） | ThermoFisher | 35050038 | 储存浓度：100倍 |
| Hepes | 赛默飞世尔科技 | 15630056 | 储存浓度：1 M |
| 小鼠EGF | R&D | 2028-EG-200 | 储存浓度：500 µg/mL 在 PBS 中 |
| 小鼠Noggin | R&D | 1967-NG/CF | 储存浓度：100 µg/mL 在 PBS 中 |
| 小鼠 R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | 储存浓度：50 µg/mL 在 PBS 中 |
| N-2 补充剂 | 赛默飞世尔科技 | 17502048 | 储存浓度：100倍 |
| 青霉素-链霉素（P/S） | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | 储存浓度：100倍浓缩液（每毫升含10,000单位青霉素和10,000 µg/mL 的链霉素 |
| <强>材料</strong> | |||
| 70 µm细胞滤筛 | 康宁 | 352350 | |
| 96孔圆底板 | 康宁 | 3799 | |
| 球头剪 | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® 深红色试剂 | 赛默飞世尔科技 | C10422 | |
| DAPI（4’,6-二脒基-2-苯并咪唑酮é尼吲哚二盐酸盐（荧光探针） | ThermoFisher | D1306 | 10 mg/mL 的储备液 |
| 不含钙不含镁的1×DPBS缓冲液（DPBS） | 赛默飞世尔科技 | 14190144 | |
| 基底膜基质（无酚红、生长因子减少型 Matrigel） | 康宁 | 356231 | 收到后在冰箱中过夜解冻，置于冰上1小时，分装成500 mL等份，于-20 °C保存 °C |
| N-乙酰半胱氨酸（NAC） | Sigma | A9165 | |
| 过氧化叔丁基（tBCHP）溶液（70% wt.，以 H2O2 计） | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express 酶（1X），无酚红（胰蛋白酶） | 赛默飞世尔科技 | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0 | 赛默飞世尔科技 | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | 用于组织解离过程中减少细胞死亡的ROCK抑制剂 |
| <强>项目与设备</strong> | |||
| Attune NxT（流式细胞仪） | ThermoFischer | 流式细胞仪分析仪 | |
| FlowJo | BD生物科学 | FACS 分析 | |
| Prism | GraphPad Software | 统计分析 |
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