来源：Yang, W. S. 等人， 体外 SUMO化检测法研究SUMO E3连接酶活性 视频实验杂志 (2018)
本视频演示了 体外 利用连续酶级联反应对底物蛋白进行SUMO化修饰的方法。此外，通过电泳和免疫印迹技术鉴定蛋白的SUMO化状态。
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方法文章
SUMO化检测实验：一种通过免疫印迹法体外检测底物蛋白SUMO化状态的技术
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 杆状病毒表达载体的制备
- 通过将 K-bZIP 的 cDNA 克隆至带有 N 端表位标签的双表达杆状病毒载体（见材料表）中，纯化 SUMO E3 连接酶 K-bZIP。我们已成功使用八肽标签（在本方案中统一表示为载体-标签-K-bZIP）。
注意： 用于K-bZIP聚合酶链式反应（PCR）克隆的DNA模板是经多西环素处理后，从TREx F3H3-K-Rta BCBL-1细胞中提取的RNA逆转录获得的cDNA。- 将全长 K-bZIP cDNA 转移至双表达载体中 CpoI 克隆位点。 Cpo将PCR产物与1 µg双表达载体在37 °C下消化3 h。
- 在0.8%琼脂糖凝胶上电泳后，分离并回收消化后的DNA。根据制造商说明书，将插入片段（K-bZIP）与载体在16 °C下用T4 DNA连接酶连接30分钟（参见 材料表).
- 将5 µL连接DNA加入50 µL感受态细胞中 E. coli 细胞“A”（参见 材料表在1.5 mL离心管中混匀，冰上放置30分钟。随后将1.5 mL离心管置于42 °C水浴中孵育45秒，立即放回冰上静置3分钟。
- 加入 600 µL S.O.C. 培养基（0.5% (w/v) 酵母提取物，2% (w/v) 胰蛋白胨，10 mM NaCl，2.5 mM KCl，20 mM MgSO₄）4，以及4%（w/v）葡萄糖）加入管中，在37 °C下孵育1小时。然后在室温下以600 x g离心3分钟 g.
- 移去上清液，用60 µL LB培养基（LB；1% (w/v) 胰蛋白胨、0.5% (w/v) 酵母提取物和85 mM NaCl）重悬沉淀，涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板。将琼脂平板于37 °C培养16 h。
- 挑选单菌落接种于5 mL含100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C、250 rpm振荡培养16 h。随后，按照质粒提取试剂盒的制造商说明，提取质粒vector-tag-K-bZIP（参见 材料表).
- 通过将载体-tag-K-bZIP转化至感受态细胞中，构建携带tag-K-bZIP的重组杆状病毒基因组（bacmid） E. coli 细胞“B”（参见 材料表).
- 将0.2 µg载体-tag-K-bZIP质粒与100 µL感受态细胞混合 E. 将大肠杆菌细胞“B”加入1.5 mL离心管中，冰上放置30分钟。将离心管置于42 °C水浴中孵育45秒，随后立即放回冰上冷却3分钟。
- 向离心管中加入900 µL S.O.C. 培养基，于37 °C、50 rpm振荡培养4 h。随后取10 µL培养液，加入额外50 µL S.O.C. 培养基混匀，涂布于含有50 µg/mL卡那霉素、7 µg/mL庆大霉素、10 µg/mL四环素、100 µg/mL半乳糖苷酶底物和40 µg/mL异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的LB琼脂平板上，于37 °C培养48 h。
- 挑取一个白色菌落接种于5 mL含有50 µg/mL卡那霉素、7 µg/mL庆大霉素和10 µg/mL四环素的LB培养基中，37 °C、250 rpm振荡培养16小时。
- 分离含有tag-K-bZIP的重组bacmid DNA，定量后重悬于浓度为1 µg/µL的溶液中。
- 通过将含有标签-K-bZIP的1 µg重组杆状病毒基因组DNA转染至6孔板中一孔的Sf9细胞内，生成表达标签-K-bZIP的重组杆状病毒。
- 种子 2 × 106 Sf9细胞（参见 材料表在6孔板的每孔中加入2 mL Grace昆虫培养基，培养基中含10%胎牛血清（FBS）和1%庆大霉素，置于27 °C孵育1小时。
- 在27 °C、140 rpm振荡条件下，将Sf9细胞培养于添加了10% FBS、1%庆大霉素和1%去垢剂C（见材料表）的Grace昆虫培养基中，保持其处于对数生长期。使用血细胞计数板和台盼蓝染色法进行细胞计数；细胞活力应超过95%。每2–3天以1:3的传代比例进行传代培养（最低密度约为0.5 × 10⁶ cells/mL）。6 细胞/毫升
- 向一个2 mL离心管中加入2 µL杆状病毒DNA（1 µg/µL）和98 µL低血清培养基（见材料表）。然后向管中加入4 µL转染试剂（见材料表），充分混匀。室温孵育15分钟。
- 将该转染混合物（104 µL）加入每孔中，在27 °C孵育12–16 h。
- 轻轻吸除耗尽的培养基，更换为 2 mL 新鲜的 Grace 昆虫培养基，其中添加 10% FBS 和 1% 庆大霉素。Sf9 细胞与培养板表面结合较松，轻柔吸液不会影响细胞。
- 转染后收集重组杆状病毒，并扩增杆状病毒以获得高滴度的病毒原液（P1），用于后续实验。
- 更换培养基72小时后，使用无菌细胞刮刀刮取Sf9细胞，将每个孔中的上清液收集至1.5 mL离心管中，并涡旋振荡10秒。
- 在 4 °C 下以 150 x g 离心 3 分钟 g收集上清液作为P0代杆状病毒，分装至1.5 mL离心管中（每管1 mL杆状病毒），于-80 °C保存。
- 接种 1 × 107 在10 cm培养皿中，将Sf9细胞置于含10% FBS和1%庆大霉素的10 mL Grace昆虫培养基中，于27 °C孵育1 h。
- 为了扩增表达标签-K-bZIP的重组杆状病毒，将0.5 mL P0杆状病毒加入已接种的Sf9细胞中，于27 °C培养48 h。
- 收集上清液至15 mL离心管中作为P1代杆状病毒，4 °C保存，可保存长达1个月。
2. K-bZIP 的纯化
- 按照步骤1.3.2所述方法，在27 °C、140 rpm的振荡条件下，使用添加10% FBS、1%庆大霉素和1%去垢剂C的Grace昆虫培养基维持Sf9细胞的对数生长期培养。
- 转导当天，将1 mL含有杆状病毒的上清液（P1）加入250 mL密度为2 × 106 个细胞/mL的Sf9细胞培养物中。
- 将Sf9细胞在27 °C、140 rpm的旋转摇床上孵育72小时，随后在4 °C下以2,740 ×g离心15分钟收集细胞。
- 弃去上清液，将细胞沉淀在10 mL裂解缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.9，0.5 M NaCl，1%去垢剂A（见材料表），2%甘油，蛋白酶抑制剂混合物）中重悬，在4 °C下以50 rpm在悬浮混合器上旋转孵育30分钟。
- 将细胞裂解物在15,000 × g离心15分钟，收集上清液。
- 为纯化tag-K-bZIP，将细胞裂解物（10 mL）与50 µL抗体标记的磁珠在14 mL聚丙烯管中混合，在4 °C下以50 rpm在悬浮混合器上旋转孵育3小时。蛋白结合完成后，在4 °C下以800 × g离心30秒使磁珠沉淀。弃去大部分上清液，用残留的约1 mL液体重悬磁珠，并转移至1.5 mL离心管中进行洗涤。
- 将含有磁珠的离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附至管壁后，移除上清液，以洗涤结合的蛋白。
- 用裂解缓冲液洗涤磁珠四次。
- 向1.5 mL离心管中加入1 mL裂解缓冲液，倒置混匀10次。将1.5 mL离心管置于磁力架上，按步骤2.7所述方法弃去上清液。
- 重复上述步骤3次。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤磁珠一次。
- 向1.5 mL离心管中加入1 mL PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8 mM Na2HPO4，1.5 mM KH2PO4），倒置混匀10次。
- 将1.5 mL离心管置于磁力架上，随后弃去上清液。
- 向1.5 mL离心管中加入100 µL用PBS稀释的150 µg/mL八肽，从抗体标记的磁珠上洗脱tag-K-bZIP蛋白。在室温下使用悬浮混合器以50 rpm旋转10分钟。然后将离心管放回磁力架上，收集含有K-bZIP的上清液至洁净的1.5 mL离心管中。
- 取1–5 µL纯化的tag-K-bZIP蛋白进行SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝染色分析。在同一块凝胶上加载2 µg、1 µg和0.5 µg的牛血清白蛋白（BSA）样品，使用ImageJ等图像处理软件进行定量分析，并通过与BSA标准品比较估算K-bZIP的浓度。
- 纯化后的K-bZIP现已可用于各SUMO化反应体系。将K-bZIP用PBS稀释至终浓度为100 ng/µL，并分装后于-80 °C保存。
3. SUMO化检测实验
- 向每份主混合物中加入 3 µL 浓度为 100 ng/µL 的纯化 tag-K-bZIP 体外 SUMO化反应。主反应混合物的组分包含1 µL蛋白质缓冲液、1x SUMO化缓冲液、0.5 µL p53蛋白（0.5 mg/mL）、25 nM E1激活酶（储存浓度：1 µM）、50 nM E2结合酶（储存浓度：10 µM），以及每种SUMO肽（SUMO-1、SUMO-2或SUMO-3；储存浓度：5 µM）各250 nM，最终体积为17 µL。
- 轻轻混匀内容物，在30 °C下孵育反应3小时。加入20 µL 2x SDS-PAGE上样缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 6.8，4% 十二烷基硫酸钠，0.2% (w/v) 溴酚蓝，20% (v/v) 甘油，200 mM β-巯基乙醇）终止反应，并在95 °C下变性样品5分钟。
- 在SDS-PAGE上分离样品，使用半干式电泳转膜仪将分离的蛋白质转移至PVDF膜，然后用抗p53抗体进行Western blot分析。
- 设置凝胶电泳装置，将20 µL样品加入凝胶孔中。
- 以恒定电流80 V运行10%凝胶约120分钟（直至染料条带迁移至凝胶底部）。电泳完成后，关闭电源。
- 断开电泳装置和胶片夹，取出凝胶，并将凝胶漂浮于半干转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl, 39 mM 甘氨酸, 20% 甲醇）中，孵育5分钟。
- 取另一个容器，将PVDF膜浸入甲醇中1分钟。随后将PVDF膜从甲醇中取出，放入半干转印缓冲液中，轻轻振荡5分钟。
- 取下半干电泳仪的安全盖。
- 预先润湿滤纸，并在底部铂阳极上制备凝胶三明治结构，顺序如下：滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸。
- 固定阴极板和安全盖，以15 V恒定电流电泳90分钟。关闭电源，断开半干转装置，取出PVDF膜。
- 用封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（137 mM NaCl₂，20 mM Tris-HCl，0.1%去垢剂B（见材料表），pH 7.6））在室温下以30 rpm转速于摇床上孵育1小时，封闭PVDF膜。
- 将PVDF膜与用封闭缓冲液按1:1,000稀释的抗p53抗体在4 °C下孵育12–16小时，使用悬浮混合器以30 rpm振荡。
- 将PVDF膜取出放入容器中，并加入TBST。用TBST再冲洗PVDF膜两次。
- 将PVDF膜浸泡在TBST中，使用旋转摇床以45 rpm振荡30分钟。
- 将PVDF膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体按1:4,000比例用封闭缓冲液稀释后，在室温下以30 rpm振荡孵育1小时，使用悬浮混合器进行杂交。
- 按照步骤 3.4.10 所述，用 TBST 洗涤 PVDF 膜 3 次。
- 将PVDF膜置于TBST中，使用悬浮混合器以45 rpm振荡浸泡30分钟。移除TBST，加入PBS，在4 °C下保存PVDF膜，最长可保存12小时。
- 将增强型化学发光底物（ECL底物）试剂1和试剂2按1:1比例混合（见材料表）。从PBS中取出PVDF膜，用纸巾或轻质擦拭布轻轻吸干多余液体，立即在每张膜表面加入400 µL ECL试剂，孵育3–5分钟。用纸巾短暂吸除多余的ECL试剂，但切勿让膜完全干燥。
- 使用化学发光成像系统或放射自显影胶片曝光印迹。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | 双表达杆状病毒载体 |
| pCR2.1-TOPO 载体 | Invitrogen | PCR 产物克隆载体 | |
| 感受态细胞 E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | 感受态 E. coli 细胞 A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | 感受态 E. coli 细胞 B |
| FugeneHD | Roche | 4709705001 | 转染试剂 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | 低血清培养基 |
| T4 连接酶 | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | β-半乳糖苷酶底物 |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s 昆虫培养基 | Gibco | 11605094 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10082147 | |
| 庆大霉素 | Thermo Fisher | 15750060 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| 卡那霉素 | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| 庆大霉素 | Gibco | 15710-064 | |
| 四环素 | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB 培养基 | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-巯基乙醇 | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS（碱） | J.T.Baker | 4109-06 | |
| 脱脂奶粉 | Fonterra | ||
| 甘油 | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | 去垢剂 A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | 去垢剂 B |
| 泊洛沙姆 188 溶液 | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | 去垢剂 C |
| 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag 肽段 | Sigma | F4799 | |
| 抗 FLAG m2 磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 | 抗体标记磁珠 |
| SUMOlink SUMO-1 试剂盒 | Active Motif | 40120 | 标准 SUMO 化实验方案 |
| SUMOlink SUMO-2/3 试剂盒 | Active Motif | 40220 | 标准 SUMO 化实验方案 |
| QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒 | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN 质粒小提试剂盒 | QIAGEN | 12123 | 质粒提取试剂盒 |
| 聚丙烯离心管 | Falcon | 352059 | |
| 培养皿 | Falcon | 351029 | |
| 细胞刮 | Corning | CNG3008 | |
| 加样尖 | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF 膜 | PerkinElmer | NEF1002 | |
| 印迹滤纸 | Bio-Rad | 1703932 | |
| 小型垂直电泳装置（Bio-Rad Mini Protean II Cell） | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD 半干式电转移装置 | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL 蛋白印迹试剂 | Thermo | 32106 | ECL 试剂 |
| 悬浮混合仪 | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| 旋转摇床 | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | 28955810 | |
| 生物分子成像仪 | GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 细胞 | Thermo Scientific | B82501 | |
| 抗 p53 抗体 | Cell Signaling | #9282 | |
| 抗兔抗体 | GE Healthcare | NA934-1ML |
