基于荧光微孔板的放线菌酮追踪实验：一种监测荧光标记核内错误折叠蛋白降解动力学的技术

摘要

来源：Guo, L. 等，细胞中错误折叠蛋白质降解的检测方法。J. Vis. Exp. (2016)

本视频介绍了一种 体外 基于荧光的微孔板检测法，用于研究转染哺乳动物细胞核内表达的荧光标记错误折叠荧光素酶突变体蛋白的降解动力学。该检测方法通过使用翻译抑制剂和蛋白酶体抑制剂处理表达荧光突变蛋白的细胞，以评估蛋白酶体介导的错误折叠蛋白的降解过程。

方案

1. ​试剂的配制

1. 为使用微孔板荧光读板仪的检测准备低荧光 DMEM 培养基。加入 25 mM 葡萄糖、0.4 mM 甘氨酸、0.4 mM 精氨酸、0.2 mM 半胱氨酸、4.0 mM 谷氨酰胺、0.2 mM 组氨酸、0.8 mM 异亮氨酸、0.8 mM 亮氨酸、0.8 mM 赖氨酸、0.2 mM 甲硫氨酸、0.4 mM 苯丙氨酸、0.4 mM 丝氨酸、0.8 mM 苏氨酸、0.078 mM 色氨酸、0.4 mM 酪氨酸、0.8 mM 缬氨酸、1.8 mM CaCl₂、0.81 mM MgSO₄、5.33 mM KCl、44.0 mM NaHCO₃、110 mM NaCl、0.9 mM NaH₂PO₄。用 HCl 或 NaOH 调节溶液 pH 至 7.4。通过过滤对培养基进行灭菌。
   注意：该培养基包含高葡萄糖标准 DMEM 培养基的组分，但省略了 Fe(NO₃)₃、维生素和酚红。常规 DMEM 培养基中的酚红、核黄素和吡哆醛会显著干扰荧光信号的检测。不含这些组分的培养基对于成功进行活细胞 GFP 成像至关重要。该培养基在冷藏保存条件下可保持稳定长达 12 个月。

2. 使用荧光酶标仪对NLS-荧光素酶-GFP进行实时降解检测

....

结果

图1：基于荧光微孔板的NLS-LucDM-GFP降解检测。 将HeLa细胞接种于96孔板中，分别转染0.05 µg (A) 或0.1 µg (B) 的NLS-LucDM-GFP，并用CHX处理，同时加入或不加入MG132。(A) 和 (B) 在指定时间点测定各孔的荧光强度（均值±标准差，n = 3）。左侧图示为原始荧光读数，右侧图示为相对于各处理组Time 0读数归一化后的数值。采用重复测量的双.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Life Technologies	11995-092
胎牛血清	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
氨基酸	Sigma-Aldrich		氨基酸用于配制低荧光培养基
放线菌酮	Sigma-Aldrich	C7698
Olympus IX-81 倒置荧光显微镜	Olympus	IX71/IX81
96孔黑色TC板，带半透明透明底	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Prism 5	GraphPad		统计分析软件