基于荧光微孔板的放线菌酮追踪实验：一种监测荧光标记核内错误折叠蛋白降解动力学的技术

摘要

来源：Guo, L. 等，细胞中错误折叠蛋白质降解的检测方法。J. Vis. Exp. (2016)

本视频介绍了一种 体外 基于荧光的微孔板检测法，用于研究转染哺乳动物细胞核内表达的荧光标记错误折叠荧光素酶突变体蛋白的降解动力学。该检测方法通过使用翻译抑制剂和蛋白酶体抑制剂处理表达荧光突变蛋白的细胞，以评估蛋白酶体介导的错误折叠蛋白的降解过程。

方案

1. ​试剂的配制

1. 为使用微孔板荧光读板仪的检测准备低荧光 DMEM 培养基。加入 25 mM 葡萄糖、0.4 mM 甘氨酸、0.4 mM 精氨酸、0.2 mM 半胱氨酸、4.0 mM 谷氨酰胺、0.2 mM 组氨酸、0.8 mM 异亮氨酸、0.8 mM 亮氨酸、0.8 mM 赖氨酸、0.2 mM 甲硫氨酸、0.4 mM 苯丙氨酸、0.4 mM 丝氨酸、0.8 mM 苏氨酸、0.078 mM 色氨酸、0.4 mM 酪氨酸、0.8 mM 缬氨酸、1.8 mM CaCl₂、0.81 mM MgSO₄、5.33 mM KCl、44.0 mM NaHCO₃、110 mM NaCl、0.9 mM NaH₂PO₄。用 HCl 或 NaOH 调节溶液 pH 至 7.4。通过过滤对培养基进行灭菌。
   注意：该培养基包含高葡萄糖标准 DMEM 培养基的组分，但省略了 Fe(NO₃)₃、维生素和酚红。常规 DMEM 培养基中的酚红、核黄素和吡哆醛会显著干扰荧光信号的检测。不含这些组分的培养基对于成功进行活细胞 GFP 成像至关重要。该培养基在冷藏保存条件下可保持稳定长达 12 个月。

2. 使用荧光酶标仪对NLS-荧光素酶-GFP进行实时降解检测

1. 将约 1 × 10⁴ 个 HeLa 细胞接种至底部透明的黑色 96 孔组织培养板中。过夜培养后，转染时细胞融合度达到 50–70%。
   注意： 每孔直接加入含充分悬浮 HeLa 细胞的 60 µl 培养基。接种后不要额外添加培养基，也不要来回摇动培养板，否则可能导致细胞分布不均。
2. 使用转染试剂，按照制造商说明书，将 0.05–0.1 µg NLS-luciferase-GFP/pRK5 质粒转染至每孔 HeLa 细胞中。配制包含 DNA 和转染试剂的主转染混合液，并分装至各孔。每种处理条件下设三个不含 DNA 转染的细胞孔，作为背景荧光信号的对照。
   注意： 减少转染差异的另一种方法是在接种前对细胞进行转染。然而，该方法中大量表达错误折叠蛋白的细胞可能无法贴壁或存活率降低。当表达有毒性的错误折叠蛋白时，部分细胞可能无法耐受胰蛋白酶消化带来的应激。结果导致整体荧光信号显著降低。
3. 转染后 20–24 小时，在倒置荧光显微镜下观察活细胞中 GFP 的表达情况，激发波长为 450–490 nm。
4. 用真空抽吸法移除培养基。每孔加入约 200 µl 1× PBS，随后抽吸去除残留的 DMEM 培养基。
5. 每孔加入 60 µl 低荧光 DMEM 培养基（含 5% FBS 和 50 µg/ml CHX）。若需检测蛋白酶体降解，在一组样本中额外加入蛋白酶体抑制剂 MG132（10 µM）。每种处理/条件设三个复孔。
   注意： 加入 MG132 处理作为蛋白酶体降解的对照，因其对于排除其他可能导致荧光信号下降的因素（如细胞死亡和荧光淬灭）至关重要。
6. 加入 CHX 后立即使用荧光酶标仪测定 GFP 的荧光信号。
   注意： 软件测量设置见 表 1。
7. 每小时读板一次，持续 8–10 小时。每次读板后将培养板放回细胞培养孵育箱中。
8. 将数据导出为电子表格文件。以每孔多次读数的平均值作为荧光强度。将各时间点的数据归一化至各自组别中“0 时间点”的平均值。绘制归一化荧光强度随时间变化的曲线，如 图 1A、1B 及 图 2 右侧图所示。
9. 采用重复测量双因素方差分析（two-way ANOVA）对两种条件间的降解速率进行统计学分析。
   注意： 在该分析中，“荧光强度”为因变量，“处理条件”和“时间”为两个因素。重复测量双因素方差分析并非比较各个单独时间点的数据，而是分析两个处理组在整个时间过程中的差异。

表1：荧光酶标仪的测量设置。

孔板定义文件		GRE96fb
检测模式		底部荧光强度
波长	激发波长	485 nm
	激发带宽	9 nm
	发射波长	535 nm
	发射带宽	20 nm
每孔读数次数		5
增益		手动 200
积分时间		20 µs
每孔多次读取	类型	圆形（实心）
	尺寸	5×5
	边距	400 µm

结果

图1：基于荧光微孔板的NLS-LucDM-GFP降解检测。 将HeLa细胞接种于96孔板中，分别转染0.05 µg (A) 或0.1 µg (B) 的NLS-LucDM-GFP，并用CHX处理，同时加入或不加入MG132。(A) 和 (B) 在指定时间点测定各孔的荧光强度（均值±标准差，n = 3）。左侧图示为原始荧光读数，右侧图示为相对于各处理组Time 0读数归一化后的数值。采用重复测量的双...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Life Technologies	11995-092
胎牛血清	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
氨基酸	Sigma-Aldrich		氨基酸用于配制低荧光培养基
放线菌酮	Sigma-Aldrich	C7698
Olympus IX-81 倒置荧光显微镜	Olympus	IX71/IX81
96孔黑色TC板，带半透明透明底	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Prism 5	GraphPad		统计分析软件