基于细胞的腺相关病毒中和抗体检测：一种通过比色法检测血清中针对特定腺相关病毒的中和抗体的技术

摘要

来源：Bass-Stringer, S.，等。利用比色法细胞实验检测抗AAV中和抗体的逐步操作方法。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们演示了一种 体外 比色法检测绵羊血清样本中针对表达碱性磷酸酶的重组腺相关病毒6型（rAAV6）载体的中和抗体。该检测利用编码人胎盘碱性磷酸酶基因的腺相关病毒与其底物反应生成不溶性紫色产物的原理。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

检测方案的示意图见图1。

1. 初始准备

1. 用于绵羊的评估：使用8 mL血清分离管（含凝血活化剂）采集血液（参见材料表），将血液样本在室温（RT）下静置20–30分钟，随后以2,100 × g离心15分钟。试管顶部形成的澄清上清液即为血清。将澄清的水相分装至微量离心管中，并于-80 °C保存。
   注意：血清在-80 °C条件下可稳定保存约5年。采血时使用16 G针头（针尖剪除）和注射器，从清醒动物的颈静脉采集血液。
2. 将胎牛血清（FBS）置于56 °C水浴中30分钟以进行热灭活，并间歇轻轻摇动。为确保精确性，另取一个装有等体积水的瓶子插入温度计，与FBS瓶同时放入水浴中。当温度计显示达到56 °C时开始计时。
3. 所有在细胞培养操作台中进行的后续步骤均应采用规范的无菌技术和细胞培养操作。使用前用70%乙醇喷洒操作台内所有物品及表面，操作结束后用1%次氯酸钠清洁。
4. 通过将高糖（4.5 g/L）DMEM（89%）、热灭活FBS（10%）和青霉素-链霉素溶液（1%）混合，配制完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。使用无菌真空过滤系统（0.22 μm孔径，聚醚砜膜）进行过滤（参见材料表）。将配制好的完全DMEM用铝箔包裹后于4 °C保存。
5. 培养HT1080细胞（参见材料表），并在75 cm²方瓶中传代。建立多个冻存细胞株。细胞传代次数不应超过20代，因过度传代可能影响检测结果。

2. 第1天——细胞接种

1. 当HT1080细胞达到约80%融合度时进行传代。
2. 将完全DMEM培养基（步骤1.4中配制）、0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液和1×磷酸盐缓冲液（PBS）在水浴中预热至37 °C。使用抽吸系统移除传代细胞的生长培养基。
   注意：本实验方案中的所有抽吸步骤均使用连接无菌5 mL刻度吸管的真空系统。
3. 用10 mL预热（37 °C）的1× PBS洗涤细胞，然后加入4 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化3–4分钟，使细胞从培养瓶表面脱落。
4. 加入6 mL预热的完全DMEM培养基以终止胰酶消化反应，并将细胞悬液转移至50 mL离心管中。使用血细胞计数板和台盼蓝染色排除法计算活细胞数量及浓度。
5. 将细胞用预热的完全DMEM培养基稀释至浓度为1 × 10⁵ 个细胞/mL，每孔接种100 μL细胞悬液至透明平底96孔板中（每孔含1 × 10⁴ 个细胞）。将培养板置于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下孵育过夜，时间为16–22小时。

3. 第2天——感染细胞

1. 从培养箱中取出培养板，使用倒置显微镜观察，确认细胞在孔内分布均匀，且融合度约为50%。若细胞融合度未处于45%–55%范围内，请重复“第1天”实验步骤，并相应调整初始细胞接种浓度。
2. 使用预热的完全DMEM培养基作为稀释液，在1.5 mL微量离心管中对目标血清样本进行系列稀释。表1展示了三个重复样本的稀释梯度制备方法。
   1. 为实现三重复实验，将AAV6-hPLAP病毒储备液（见材料表）用1×PBS稀释，配制浓度为7.5 × 10⁶ 拷贝基因组（vg）/μL的工作液。
   2. 向每管含有264 μL血清/培养基稀释液的试管中加入66 μL的7.5 × 10⁶ vg/μL病毒工作液（总体积为330 μL/稀释度，见表1）。
      注意：本实验具有良好的稳健性，无需极其严格的细胞培养条件。但为了准确定量并确保每次实验结果可靠，必须在所有培养板中设置以下对照：（1）仅含病毒和培养基的对照，（2）仅含培养基的对照，以及（3）中和抗体阳性对照样本，且均需在相同实验条件下进行。上述体积（330 μL）已包含三重复样本及血清与病毒混合液额外10%的损耗。强烈建议设置重复样本，以准确评估中和活性。
3. 使用移液器轻轻混匀各病毒/血清稀释液，将含有病毒/血清混合物的离心管置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育30分钟，以允许潜在的中和反应发生。
4. 向每孔含有1 × 10⁴ 个细胞的96孔板中加入100 μL病毒/血清混合液，每个稀释度对应一孔。
   注意：此操作将使每孔终病毒感染复数（MOI）达到15,000病毒颗粒/细胞。表2提供了一个评估样本至1/512稀释度的96孔板样本排布示例。
5. 用铝箔纸包裹含有细胞、血清和AAV-hPLAP的96孔板，置于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜孵育16–24小时，以允许AAV病毒进入细胞。

4. 第3天——固定细胞并加入底物

1. 将一份1x PBS预热至37 °C（约25 mL/96孔板）。另取PBS（约25 mL/96孔板）和重蒸水分别冷却₂O（去离子水，约25 mL/96孔板）置于4 °C。溶解一粒BCIP/NBT（参见 材料表在50 mL锥形离心管中，用10 mL去离子水溶解，涡旋混匀（10 mL足以用于2块96孔板）。
2. 使用连接于负压吸引系统或通风橱真空装置的移液管，吸除96孔板各孔中的培养基。将移液管管尖轻轻插入孔中，小心吸取培养基，注意避免扰动贴壁细胞。
   1. 使用移液器向每孔加入50 μL室温4%多聚甲醛。用铝箔包裹培养板，室温孵育10分钟以固定细胞。
      注意： 多聚甲醛（PFA）可能具有致癌性，经皮肤接触、眼睛接触或吸入均具毒性。操作时应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备及面罩。用磷酸盐缓冲液（PBS）新鲜配制4%多聚甲醛溶液（每块96孔板约需7 mL）。
3. 用 200 μL 室温 1x PBS 洗涤并吸弃上清，重复该步骤两次。
   注意： 多通道移液器是移液步骤的高效选择。
4. 向每个孔中加入200 μL预热的PBS，用铝箔包裹培养板，在65 °C孵育90分钟，以变性内源性碱性磷酸酶活性。
5. 吸弃孔内液体，用 200 μL 冷（4 °C）PBS 洗涤细胞。再次吸弃，加入 200 μL 冷的去离子水（DDW）洗涤，再吸弃。
6. 移液50 μL溶解的BCIP/NBT（步骤4.1中制备的) 加入每个孔中。
7. 用铝箔包裹培养板，在室温下孵育2-24小时。
   注意： 在不同实验批次之间保持孵育时间的一致性；时间上的灵活性允许用户在第3天或第4天拍摄孔板图像。
8. 使用光学显微镜相机，采用4倍物镜对每个孔拍照，确保所有检测均使用相同的曝光、白平衡和光照设置。
   1. 将每个孔的位置保持一致，并确保孔的边缘在照片中不可见。以 TIF 格式或类似格式保存照片。
      注意： 不同显微镜的具体设置可能有所差异，但为了获得最佳的定量效果，应确保各孔内的背景光照强度较高且均匀一致。图1B).

表1：为血清样品进行三重连续稀释所需血清与稀释液的体积。

稀释梯度标签	稀释倍数	3 × 样本 (240 μL) + 10% 缓冲液体积 (24 μL)	血清:培养基比例
稀释1 (D1)	1/2	264 μL 血清 + 264 μL 培养基	50:50
稀释2 (D2)	1/4	264 μL D1 + 264 μL 培养基	25:75
稀释3 (D3)	1/8	264 μL D2 + 264 μL 培养基	12.5:87.5
稀释4 (D4)	1/16	264 μL D3 + 264 μL 培养基	6.25:93.75
稀释5 (D5)	1/32	264 μL D4 + 264 μL 培养基	3.13:96.87
稀释6 (D6)	1/64	264 μL D5 + 264 μL 培养基	1.56:98.44
稀释7 (D7)	1/128	264 μL D6 + 264 μL 培养基	0.78:99.22
稀释8 (D8)	1/256	264 μL D7 + 264 μL 培养基	0.39:99.61
稀释9 (D9)	1/512	264 μL D8 + 264 μL 培养基	0.2:99.8
稀释10 (D10)	1/2048	132 μL D9 + 396 μL 培养基	0.05:99.95
稀释11 (D11)	1/8192	132 μL D10 + 396 μL 培养基	0.01:99.99
稀释12 (D12)	1/32768	132 μL D11 + 396 μL 培养基	0.003:99.997

表2：用于检测初始血清样本的96孔板布局示例，样本稀释度范围为1/2至1/512。 若需检测已知含有AAV中和抗体的样本（给药后样本）或需要更高滴度时，可将更高倍数的稀释样本纳入实验。MO (-C)：仅培养基对照。VO (+C)：病毒与仅培养基对照。mAb：抗AAV单克隆抗体（中和抗体阳性对照）。

血清样本 #1

血清样本 #2

血清样本 #3

单克隆抗体（mAB）、对照及额外样本

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

50 ng MAb

50 ng MAb

50 ng MAb

B

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

5 ng MAb

5 ng MAb

5 ng MAb

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

0.5 ng MAb

0.5 ng MAb

0.5 ng MAb

D

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

MO (-C)

MO (-C)

MO (-C)

E

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

VO (+C)

VO (+C)

VO (+C)

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

样本 #1 1/512

样本 #1 1/512

样本 #1 1/512

G

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

样本 #2 1/512

样本 #2 1/512

样本 #2 1/512

H

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

样本 #3 1/512

样本 #3 1/512

样本 >#3 1/512

结果

图1：中和抗体（NAb）检测实验方案示意图。（A） 中和抗体检测的可视化流程，展示为期三天实验方案的主要步骤。简而言之，细胞接种后培养过夜；次日，制备血清系列稀释液，与腺相关病毒（AAV）共同孵育，随后加入细胞中继续孵育过夜；第三天，固定细胞，洗涤，孵育，加入底物反应，再次孵育，最后进行成像与定量分析。（B） 最小信号对照（AAV完全被抑制）、最大信号对照（无抑制）以及一份绵羊血清样本（信号抑制约50%）的代表性图像。比例尺 = 0.5 mm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶/EDTA	Gibco	25300-054
50 mL 锥形离心管	Falcon	14-432-22	或同等产品
75 cm<sup>2</sup> 方形培养瓶	Falcon	353136	或同等产品
96孔平底板	Falcon	353072
AAV6-CMV-hPLAP 载体			肌肉研究 &amp; 治疗学实验室（澳大利亚墨尔本大学）AAV6-CMV-hPLAP 可根据要求提供。
铝箔
抗完整AAV6小鼠单克隆抗体（ADK6）	PROGEN	610159	阳性对照单克隆抗体
BCIP/NBT	SIGMAFAST	&nbsp;B5655
细胞和组织培养安全柜
电子移液器			5 &amp; 10 mL 移液管吸头
胎牛血清	&nbsp;Gibco	10099-141
血细胞计数板
高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）	Gibco	11965118
HT1080 细胞	ATCC
培养箱			37 &deg;C，5% CO<sub>2</sub>
带摄像头的光学显微镜			能够使用4倍物镜拍摄照片
烘箱			对于65 &deg;C孵育
多聚甲醛	MERCK	30525-89-4
水浴锅
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122