体外持留菌检测：一种评估渗透保护剂对细菌持留作用影响的方法

摘要

来源：Karki, P. 等. 高通量筛选化学化合物以阐明其对细菌持留现象的影响。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们演示了一种评估渗透保护剂对细菌持留菌形成影响的方法。首先将细菌细胞暴露于渗透保护剂中以诱导渗透胁迫，从而触发持留菌的形成，随后使用抗生素处理，以定量持留菌数量。

方案

1. 培养基、氧氟沙星溶液和E. coli菌种的制备

1. 常规LB培养基（Luria-Bertani培养基）：在去离子水（DI水）中加入10 g/L胰蛋白胨、10 g/L氯化钠（NaCl）和5 g/L酵母提取物。通过高压灭菌法对培养基进行灭菌。
2. LB琼脂平板：在去离子水中加入10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物和15 g/L琼脂，通过高压灭菌法灭菌。在适当温度（约55 °C）下，将约30 mL琼脂培养基倒入方形培养皿（10 × 10 cm）中。晾干平板后于4 °C保存。
3. 改良LB培养基：在去离子水中加入10 g/L胰蛋白胨和5 g/L酵母提取物，通过高压灭菌法灭菌。
4. 含渗透调节剂的改良LB培养基：将2倍浓度的改良LB培养基与2倍浓度的渗透调节剂溶液等体积混合。制备2倍浓度改良LB培养基时，在去离子水中加入20 g/L胰蛋白胨和10 g/L酵母提取物，并通过高压灭菌法灭菌。制备2倍浓度渗透调节剂溶液时，将目标渗透调节剂（2倍用量）溶解于去离子水中，然后通过滤膜灭菌。 
   注意：目标渗透调节剂及其浓度可依据表型微阵列筛选实验（见方案4）确定。然而，所测试的渗透调节剂及其对应的2倍浓度可根据研究性质进行调整。例如，若需研究1 mM氯化钠的影响，则2倍渗透调节剂溶液应为2 mM氯化钠溶液。
5. 氧氟沙星储备液（5 mg/mL）：将5 mg氧氟沙星（OFX）盐溶于1 mL去离子水中，加入10 µL 10 M氢氧化钠以提高OFX在水中的溶解度，随后通过滤膜灭菌。分装后于-20 °C保存。
   注意：氧氟沙星是一种喹诺酮类抗生素，广泛用于生长和非生长状态细菌的研究14,21。氧氟沙星对大肠杆菌E. coli MG1655的最小抑菌浓度（MIC）范围为0.039–0.078 μg/mL。此外，其他抗生素如氨苄西林和卡那霉素也常用于持留菌研究。抗生素的选择取决于具体研究需求。
6. E. coli MG1655菌种保存液：  在14 mL带螺旋盖试管中，将单菌落接种至2 mL常规LB培养基中，在摇床中以250 rpm、37 °C培养。当菌体进入稳定期后，取500 μL菌液与500 μL无菌50%甘油混合，置于冻存管中，于-80 °C保存。

2. 扩增细胞以消除预先存在的持留菌

1. 准备过夜培养物：用无菌移液器吸头从冷冻细胞储备液中刮取少量细胞（不要解冻甘油保存的细胞储备液），接种到装有 2 mL 改良 LB 培养基的 14 mL 带螺帽试管中。将细胞在 250 rpm、37 °C 条件下的摇床中培养 12 小时。
2. 第一次扩增
   1. 培养 12 小时后，将过夜培养物 250 µL 转移至装有 25 mL 新鲜改良 LB 培养基的 250 mL 有挡板的锥形瓶中，瓶口用无菌铝箔覆盖。
   2. 将细胞培养物在 250 rpm、37 °C 条件下的摇床中培养，直至细胞达到对数中期（OD₆₀₀ = 0.5）。
   3. 每 30 分钟使用微孔板读数仪测量一次 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀）。
3. 第二次扩增
   1. 当 OD₆₀₀ = 0.5 时，将第一个锥形瓶中的 250 µL 细胞培养物稀释至装有 25 mL 新鲜改良 LB 培养基的 250 mL 有挡板的锥形瓶中。
   2. 将第二次的细胞培养物在 250 rpm、37 °C 条件下的摇床中培养，直至 OD₆₀₀=0.5。
   3. 每 30 分钟测量一次光密度。
      注意：过夜培养物可能含有大量持留细胞。上述稀释/生长循环方法可用于在将细胞转移至微阵列之前消除这些预先存在的持留细胞。可通过使用 方案 3 中描述的检测方法定量测定过夜培养物中的持留细胞水平，以验证其是否已被清除。

3. 验证清除预先存在的持留细胞

1. 第二次传代后（见步骤 2.3），将 250 µL 细胞培养物（OD₆₀₀ = 0.5）稀释至 25 mL 新鲜改良 LB 培养基中，置于 250 mL 带挡板的锥形瓶中。
   注意：作为对照，将 250 µL 过夜培养物（见步骤 2.1）稀释至 25 mL 新鲜改良 LB 培养基中，置于 250 mL 带挡板的锥形瓶中。在将细胞转移至锥形瓶前，应使用新鲜改良 LB 培养基调节过夜培养物的细胞密度，使其 OD₆₀₀ = 0.5。
2. 向细胞悬液中加入 25 µL OFX 储存液（5 mg/mL），轻轻振荡锥形瓶，使检测培养物混合均匀。检测培养物中 OFX 的终浓度为 5 µg/mL。
3. 将检测培养物置于摇床中，在 250 rpm、37 °C 条件下孵育。
4. 在处理期间每小时（包括 0 h，即向检测培养物中加入 OFX 前的时间点），从锥形瓶中取出 1 mL 检测培养物，转移至 1.5 mL 微量离心管中。
5. 在微量离心管中以 17,000 x g 离心 3 分钟。
6. 小心移除 950 µL 上清液，避免扰动细胞沉淀。
7. 向微量离心管中加入 950 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。
8. 重复洗涤步骤 3.5–3.7，共进行 3 次，直至抗生素浓度低于最低抑菌浓度（MIC）。
9. 最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于 100 µL PBS 溶液中，得到 10 倍浓缩的样品。
10. 取 10 µL 细胞悬液，在 96 孔圆底板中用 90 µL PBS 溶液进行连续六次系列稀释。
11. 取 10 µL 稀释后的细胞悬液点样于不含抗生素的新鲜琼脂平板上。为提高检测下限，将剩余的 90 µL 细胞悬液接种至另一新鲜琼脂平板上。
12. 将琼脂平板在 37 °C 下孵育 16 小时，然后计数菌落形成单位（CFUs）。计算检测培养物每毫升总 CFU 数时，需考虑稀释倍数。通过绘制抗生素处理时间对应的对数 CFU 值，生成杀菌曲线。
    注意：对 E. coli 细胞进行 6 小时 OFX 处理足以获得双相杀菌曲线。传代细胞的持留水平（以 6 小时 CFU 计数衡量）应显著低于过夜培养物。根据实验设计，方案 2 和 3 中描述的操作可使用常规 LB 培养基进行。 

4. 微阵列板筛选

1. 准备微阵列细胞培养
   1. 将250 µL对数生长期的细胞转移至含有25 mL新鲜改良LB培养基的50 mL离心管中。轻轻混匀细胞悬液，使其均匀。
      注意：对数生长期的细胞（OD₆₀₀ = 0.5）来自第二次传代培养步骤（见步骤2.3）。
   2. 将稀释后的细胞悬液转移至无菌的50 mL储液槽中。
   3. 使用多通道移液器，将150 µL细胞悬液加入微阵列的每个孔中，即含有不同渗透调节剂的96孔板中。 
      注意：不含渗透调节剂的孔作为对照。
   4. 用透气性密封膜覆盖微阵列板。
   5. 将板置于37 °C、250 rpm的摇床中孵育24小时。
      注意：在这些实验中，使用了市售的微阵列板，例如Phenotype Microarrays（PM-9和PM-10），其包含多种浓度的多种渗透调节剂、pH缓冲液及其他化学物质，以干燥状态固定于板上。这些微阵列采用半面积96孔板格式。应根据所用板的类型调整培养体积。微阵列也可手动制备。
2. 微阵列板的手动制备
   1. 将75 μL的2倍浓度渗透调节剂溶液加入半面积96孔板的各个孔中。
   2. 将500 µL对数生长期的细胞加入含有25 mL 2倍浓度改良LB培养基的50 mL离心管中。轻轻混匀细胞悬液，使其均匀。
      注意：接种量已调整为与4.1节所述微阵列筛选方案保持一致。 
   3. 将75 μL细胞悬液加入含有2倍浓度渗透调节剂溶液的半面积96孔板的每个孔中。
   4. 将板置于37 °C、250 rpm的摇床中孵育24小时。
3. 准备持留菌检测板
   1. 在50 mL离心管中制备25 mL含有5 µg/mL OFX的改良LB培养基，并将该培养基转移至无菌储液槽中。
   2. 使用多通道移液器，将储液槽中的含OFX改良LB培养基190 µL加入通用平底96孔板（持留菌检测板）的每个孔中。
   3. 从摇床中取出微阵列板（培养24小时后），将10 µL细胞培养物从微阵列板转移至持留菌检测板的孔中，后者含有含OFX的改良LB培养基。
   4. 从持留菌检测板中取出10 µL细胞悬液，使用圆底96孔板和多通道移液器，在290 µL PBS溶液中连续稀释三次。
   5. 完成连续稀释后，使用多通道移液器将所有连续稀释的细胞悬液各10 µL点样于不含抗生素的新鲜琼脂平板上。 
   6. 将持留菌检测板（在步骤4.3.3中制备）用透气性密封膜封板后，置于37 °C、250 rpm的摇床中孵育6小时。
   7. 摇床中孵育6小时后，取出持留菌检测板，并重复步骤4.3.4–4.3.5。
   8. 将琼脂平板在37 °C孵育16小时，然后计数CFU。抗生素处理前后的CFU水平可用于计算每个孔中的持留菌比例。OFX处理前的CFU计数也有助于评估渗透调节剂对E. coli存活率的影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 毫升试管	Fisher Scientific	14-959-1B
平底 96 孔板	USA Scientific	5665-5161
透气性密封膜	VWR	102097-058	经伽马辐照灭菌，无细胞毒素
半面积平底 96 孔板	VWR	82050-062
LB 琼脂	Fisher Scientific	BP1425-2	分子遗传学级
氧氟沙星盐	VWR	103466-232	HPLC ≥97.5
表型微阵列（PM-9 和 PM-10）	Biolog	N/A	PM-9 和 PM-10 板分别含有多种渗透调节剂和缓冲液
圆底 96 孔板	USA Scientific	5665-0161
氯化钠	Fisher Scientific	S271-500	符合 ACS 认证级
硝酸钠	Fisher Scientific	AC424345000	ACS 试剂级
亚硝酸钠	Fisher Scientific	AAA186680B	纯度 98%
方形培养皿	Fisher Scientific	FB0875711A
胰蛋白胨	Fisher Scientific	BP1421-500	分子遗传学级
Varioskan Lux 多功能微孔板读数仪	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0	用于在 600 nm 处测量光密度
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-100	分子遗传学级