基于荧光报告基因的麻痹检测法：一种评估年龄相关性多聚谷氨酰胺荧光报告基因进行性形成及其相关麻痹的技术Caenorhabditis elegans

摘要

来源：Lazaro-Pena, M. I. 等. 量化组织特异性蛋白质稳态功能衰退 秀丽隐杆线虫. J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了一种 体内 基于成像的检测方法以确定由衰老引起的蛋白质稳态衰退。该检测方法利用 秀丽隐杆线虫 在体壁肌肉中表达多聚谷氨酰胺-YFP融合蛋白，以检测多聚谷氨酰胺随年龄增长的聚集情况及蛋白毒性诱导，进而导致瘫痪。

方案

1. 利用表达多聚谷氨酰胺的动物测量肌肉组织中蛋白质稳态的下降

注意： 可采用两种方法来鉴定肌肉细胞中蛋白质稳态的下降：通过成像技术观察衰老过程中蛋白质聚集体的形成（1.1），以及通过测量这些聚集体随年龄增长引发的蛋白毒性所导致的瘫痪发生情况（1.2）。

1. 在衰老过程中成像肌肉中的多聚谷氨酰胺聚集物形成
   注意： 使用与黄色荧光蛋白（YFP）融合的多聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列，对肌肉细胞中蛋白质聚集的老龄依赖性进展进行成像。本方案概述了菌株 AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP] 的使用方法，但也可使用其他多聚谷氨酰胺变体菌株。polyQ::YFP 转基因通过 unc-54 肌肉特异性启动子在肌肉中表达。在成年期第 1、2、3 和 4 天对同步化的 unc-54p::polyQ::YFP 表达动物进行观察。为观察 unc-54p::polyQ::YFP 聚集物，使用配备荧光功能的复式显微镜或荧光解剖显微镜。AM140 菌株可从线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）获取，网址为：https://cgc.umn.edu/strain/AM140
   1. 在成像日....

结果

图 1：在 C. elegans 肌肉中表达 polyQ::YFP 导致衰老过程中焦点蛋白聚集物的逐步积累及麻痹现象。（A）成虫期第 1 天和第 4 天的 C. elegans unc-54p::Q35::YFP 表达情况（分别为上图和下图）。箭头指示典型的焦点聚集物。（B）成虫期前 4 天内荧光焦点数量的定量分析。这些焦点对荧光漂白后恢复（FRAP）具有抗性，表明其为不溶性蛋白聚集体。误差线表示平均值的标准误（SEM）。（C）unc-54p::Q35:.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃显微镜载玻片	VWR	160004-422
叠氮化钠，CAS #26628-22-8	Sigma-Aldrich	S2002
配备 AxioVision v4.8.2.0 软件的 Zeiss Axio Imager M2m 显微镜	Zeiss
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad 显微镜	Zeiss