基于荧光报告基因的麻痹检测法：一种评估年龄相关性多聚谷氨酰胺荧光报告基因进行性形成及其相关麻痹的技术Caenorhabditis elegans

摘要

来源：Lazaro-Pena, M. I. 等. 量化组织特异性蛋白质稳态功能衰退 秀丽隐杆线虫. J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了一种 体内 基于成像的检测方法以确定由衰老引起的蛋白质稳态衰退。该检测方法利用 秀丽隐杆线虫 在体壁肌肉中表达多聚谷氨酰胺-YFP融合蛋白，以检测多聚谷氨酰胺随年龄增长的聚集情况及蛋白毒性诱导，进而导致瘫痪。

方案

1. 利用表达多聚谷氨酰胺的动物测量肌肉组织中蛋白质稳态的下降

注意： 可采用两种方法来鉴定肌肉细胞中蛋白质稳态的下降：通过成像技术观察衰老过程中蛋白质聚集体的形成（1.1），以及通过测量这些聚集体随年龄增长引发的蛋白毒性所导致的瘫痪发生情况（1.2）。

1. 在衰老过程中成像肌肉中的多聚谷氨酰胺聚集物形成
   注意： 使用与黄色荧光蛋白（YFP）融合的多聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列，对肌肉细胞中蛋白质聚集的老龄依赖性进展进行成像。本方案概述了菌株 AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP] 的使用方法，但也可使用其他多聚谷氨酰胺变体菌株。polyQ::YFP 转基因通过 unc-54 肌肉特异性启动子在肌肉中表达。在成年期第 1、2、3 和 4 天对同步化的 unc-54p::polyQ::YFP 表达动物进行观察。为观察 unc-54p::polyQ::YFP 聚集物，使用配备荧光功能的复式显微镜或荧光解剖显微镜。AM140 菌株可从线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）获取，网址为：https://cgc.umn.edu/strain/AM140
   1. 在成像日（成年期第 1、2、3 和 4 天），挑选 20 只动物，并将其置于载玻片上，载玻片上预先放置含 3% 琼脂糖垫和 5 μL 10 mM 叠氮化钠（用 M9 缓冲液稀释）的液滴。
   2. 待所有动物被叠氮化钠固定后（约 5 分钟），使用 10 倍物镜对动物整体进行成像（图 1A）。成像时使用 FITC 滤光片，并对每只动物使用相同的曝光参数。成像后丢弃载玻片。
      注意： 或者，也可直接在培养皿上定量 YFP 焦点，但评分时需通过向培养皿吹送二氧化碳气流以抑制动物运动。当需要筛选大量条件时，该替代方法最为适用。
   3. 获取图像后，统计整个动物体壁肌肉中焦点的数量。焦点是指比背景中较弱的可溶性信号更亮的点状信号。
   4. 绘制第 1、2、3 和 4 天 YFP 焦点积累的进展图。绘制 XY 图，其中 X 轴表示成年天数，Y 轴表示 unc-54p::polyQ::YFP 焦点数量（图 1B）。将实验条件（例如基因下调或过表达）下的焦点数量与对照动物进行比较。对每次实验中每个时间点的各组之间进行统计学分析。
      1. 当仅比较两种条件的焦点计数时，在每个时间点进行独立样本 t 检验。
      2. 当比较超过两种条件的焦点计数时，在每个时间点进行整体单因素方差分析（one-way ANOVA），包括该时间点所有条件的数据。如果整体 ANOVA 得到显著的 p 值（即 p < 0.005），则进行事后分析（post-hoc analysis），使用成对独立样本 t 检验确定哪些特定条件之间存在显著差异（例如，对于 A、B 和 C 组，比较 A & B、A & C 和 B & C）。

2. 通过测量动物麻痹率作为肌肉细胞中多聚谷氨酰胺毒性的替代指标

注意： 肌肉中多聚谷氨酰胺（polyQ）聚集体随年龄增长而增加，导致运动功能相关的肌肉功能下降。这种运动缺陷可通过测量表达 polyQ 的动物的渐进性麻痹速率来确定。在麻痹实验中，对同步化的表达 unc-54p::polyQ::YFP 的动物在成虫期第3、5、7和9天进行评分。可根据需要增加额外的时间点，以扩展评分范围，从而评估遗传扰动的影响。

1. 在评分日（成虫期的第3、5、7和9天），观察含有50只动物的6 cm培养皿，记录瘫痪动物的数量，并将瘫痪的动物从培养皿中移除。若动物已爬出培养皿或已死亡，则应进行删失处理；记录该事件，以便在后续分析中予以考虑。
   注意：当动物在暴露于光刺激或轻触刺激后未观察到任何运动时，即视为瘫痪。通过咽部泵动活动来判断无运动动物是否存活。
2. 实验结束后，计算每种条件下的瘫痪率。在每个时间点，将该条件下瘫痪动物所占比例除以观察到的动物总数，得到瘫痪率。若每个时间点每种条件包含多个培养皿（即重复组），则需对每个重复组单独计算比值。
3. 在XY图（散点图）中绘制瘫痪率随时间的变化趋势。X轴表示成虫天数，Y轴表示瘫痪率。unc-54p::polyQ::YFP 动物的瘫痪率与对照组动物进行比较（图1C）。对各组间进行统计学分析；对于多次重复实验，应将每次实验独立处理。采用Cox比例风险回归模型及Wald检验。大多数支持生存分析的数据分析工具均支持Cox建模。
   1. 数据转换：每种条件应有两列数据，一列为时间，另一列为“事件”。在每个观察时间点，为每只瘫痪动物添加一行“0”，为每只删失动物添加一行“1”。总行数应等于该条件下起始动物的数量。
   2. 根据所用统计软件的操作说明，进行Cox比例风险建模，随后进行Wald检验。对于典型的实验设计，使用单变量模型即可。当涉及两种以上条件时，若包含所有条件的联合检验结果具有显著性（即 p < 0.005），可进一步进行条件间的两两比较，以确定具体哪些条件对之间存在显著差异。
      注意：Cox模型基于一个假设，即测试条件对事件发生概率的影响在时间上是成比例的。例如，若一种条件下大多数动物在第1天即瘫痪，而另一种条件下大多数动物在第9天才瘫痪，则不适合使用Cox模型进行比较。当比例风险假设不成立时，可采用Cox模型的扩展方法或其他在各时间点比较瘫痪比例的方法。

结果

图 1：在 C. elegans 肌肉中表达 polyQ::YFP 导致衰老过程中焦点蛋白聚集物的逐步积累及麻痹现象。（A）成虫期第 1 天和第 4 天的 C. elegans unc-54p::Q35::YFP 表达情况（分别为上图和下图）。箭头指示典型的焦点聚集物。（B）成虫期前 4 天内荧光焦点数量的定量分析。这些焦点对荧光漂白后恢复（FRAP）具有抗性，表明其为不溶性蛋白聚集体。误差线表示平均值的标准误（SEM）。（C）unc-54p::Q35:...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃显微镜载玻片	VWR	160004-422
叠氮化钠，CAS #26628-22-8	Sigma-Aldrich	S2002
配备 AxioVision v4.8.2.0 软件的 Zeiss Axio Imager M2m 显微镜	Zeiss
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad 显微镜	Zeiss