细菌共孵育实验：一种基于荧光显微镜的单细胞水平可视化种内细菌竞争的技术

摘要

来源：Smith, S.，等，利用单细胞荧光成像定量细菌间竞争，J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种基于荧光显微镜的方法，用于在单细胞水平上研究细菌间的竞争。该方法可深入了解细菌群落的结构与功能。

方案

1. 共同孵育细菌菌株

1. 选择两种细菌菌株用于单细胞细菌竞争实验。此处使用两种 V. fischeri 菌株：一种为目标菌株（ES11424），另一种为抑制菌株（MJ1125），后者已知通过染色体 II 上的 VI 型分泌系统（T6SS2）杀死目标菌株，这是一种依赖接触的杀伤机制。
2. 将菌株分别转化至稳定质粒中，这些质粒编码不同的荧光蛋白基因（如 GFP 或 RFP），以便在显微镜下直观区分菌株类型。此处，抑制菌株标记有编码 GFP 的质粒（pVSV102），目标菌株标记有编码 dsRed 的质粒（pVSV208）。
3. 以两种菌株的对数中期培养物起始，测定并记录各样品在 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀）。
4. 用 LBS 培养基稀释培养物，将各样品归一化至 OD₆₀₀ = 1.0，该值对应于约 10⁹ CFU/mL 的 V. fischeri 细胞浓度。
5. 按体积比 1:1 混合两种竞争菌株，将各 30 µL 归一化后的菌液加入已标记的 1.5 mL 离心管中。涡旋混合菌液 1–2 秒。
   注意：在某些情况下，可能需要以不同比例混合共培养物。例如，当一种菌株的生长速度明显快于另一种时，可能需要使生长较慢的菌株起始数量占优势，以便观察竞争过程。若两种菌株的 OD₆₀₀ 并不对应相似的 CFU/mL，也可能需要进行优化。
6. 对每个生物学重复和处理组重复步骤 1.5。在本示例中，共获得四个混合菌株管：两个生物学重复为野生型抑制菌株与目标菌株混合，另两个生物学重复为 VI 型分泌系统突变菌株与目标菌株混合。
7. 为确保共孵育于琼脂垫上时竞争细胞具有足够密度以实现依赖接触的杀伤，将每种混合培养物浓缩 3 倍：将混合菌液在标准 1.5 mL 离心管中以 21,130 × g 离心 1 分钟，弃上清，将沉淀重悬于 20 µL LBS 培养基中。对每个样品重复此操作。
   注意：某些细菌细胞对高相对离心力（rcf）下的离心损伤较为敏感；在此类情况下，可将混合培养物以 4600 × g 离心 3 分钟。此外，在定量依赖接触的竞争时，需确保载玻片上的细胞密度足够高以观察到杀伤效应。本文中，“密集”处理组（可观察到杀伤）的细胞密度约为 10 个细胞/20 µm²。

2. 载玻片准备

1. 使用正置显微镜时，将一块约 5 mm² 的琼脂糖垫放置在标准的 1 mm 玻璃载玻片上。在琼脂糖垫上点加 2 µL 混合培养物，并在液滴上覆盖一片 #1.5 盖玻片（25 mm²）。参见图 1B。
2. 使用倒置显微镜时，将 2 µL 混合培养物点加在 35 mm 培养皿的 #1.5 盖玻片底部，然后在共孵育点上覆盖一块约 5 mm² 的琼脂糖垫。再将一片 12 mm 圆形玻璃盖玻片置于琼脂糖垫上方。示例参见图 1C。
3. 根据所使用的显微镜配置，重复步骤 2.1 或 2.2，对剩余的三份混合培养物进行相同操作，最终获得四张载玻片或培养皿用于成像。
4. 将载玻片在实验台静置约 5 分钟后再进行后续操作。此步骤可使细胞沉降到琼脂垫上，从而在成像过程中减少细胞移动。

3. 荧光显微镜

1. 首先使用白光（相差或微分干涉差）观察细胞，以尽量减少光漂白的影响。根据单个细菌细胞的平均大小，选用60倍或100倍油镜。
2. 调整每个通道的曝光时间和采集参数，使细胞在相应通道中清晰可见，同时背景信号最小。
   注意：不同通道可使用不同的曝光时间，但对于同一通道，所有生物学重复和处理组必须使用相同的曝光时间。
3. 对每个样本，选择至少五个视野（FOV），并根据采集参数在各相应通道中获取图像（见图2中的示例）。保存每个视野的XY坐标，以便在最终时间点重新定位同一视野进行成像。在每个时间点对相同视野进行成像，对于分析阶段确定目标细胞或抑制细胞所占面积比例至关重要。
   注意：本示例中，GFP荧光使用激发波长为467–498 nm、发射波长为513–556 nm的滤光片检测，并以伪绿色显示；dsRed荧光使用激发波长为542–582 nm、发射波长为603–678 nm的滤光片检测，并以伪品红色显示。
4. 2小时后，使用先前保存的XY坐标，对每个样本重复上述步骤（图2）。
   注意：对于具有不同生长速率或竞争机制的生物体，后续图像的采集时间可能需要优化。

结果

图 1： 共培养实验用琼脂糖垫的制备与载玻片装置。（A） 制备2%琼脂糖垫的装置。将五层实验室胶带（绿色）分别缠绕在盖玻片两端，两点相距约20 mm。随后，将温热的2%琼脂糖磷酸盐缓冲海水溶液（黄色）滴加于两段胶带之间，并立即覆盖一片25 mm²的盖玻片，室温下静置至少1小时使其凝固。使用剃刀刀片将琼脂糖垫切割成约5 mm²的小块，用镊子将其转移至新的载玻片上用于成像。 （B） 在直立显微镜下成像时，先将5 mm²琼脂糖垫直接置于载玻片上，然后加入混合培养物（蓝色），最后覆盖一片12 mm圆形#1.5盖玻片...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher	05-408-129
10 µL 单通道移液器
1000 µL 单通道移液器
20 µL 单通道移液器
200 µL 单通道移液器
琼脂糖	Fisher	BP165-25	低熔点琼脂糖
Cellvis 35 mm 培养皿	Fisher	NC0409658	#1.5 盖玻片底
氯霉素	Sigma	C0378	储存液（20 mg/mL 溶于乙醇）；培养基中终浓度（2 μg/mL LBS）
FIJI 图像分析软件	ImageJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	开源软件
Fisherbrand 盖玻片：圆形	Fisher	12-545-81P	#1.5 盖玻片；直径 12 mm
硫酸卡那霉素	Fisher	BP906-5	储存液（100 mg/mL 溶于水，过滤除菌）；培养基中终浓度（1 μg/mL LBS）
镜头清洁纸	Fisher	S24530
培养皿	Fisher	FB0875713	带盖无菌
剃须刀片	Fisher	S65921
半微量比色皿	VWR	97000-586
分光光度计
Thermo Scientific Gold Seal 普通载玻片	Fisher	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific 盖玻片	Fisher	22-050-235	#1.5 盖玻片，25 mm²
类型 F 浸油	Fisher	NC0297589
配有相机和成像软件的正置或倒置荧光显微镜			本文中的图像使用 Nikon TI-2 倒置荧光显微镜，配备 ORCA-Fusion 数字 CMOS 相机和 NIS-Elements 软件采集。
涡旋振荡器
水浴锅			用于在移液前保持琼脂糖处于温热状态
<strong>LBS 培养基</strong>
1 M Tris 缓冲液（pH ~7.5）			50 mL 1 M 储存液（62 mL HCl，938 mL 去离子水，121 g Trizma Base）
技术级琼脂	Fisher	DF0812-17-9	15 g（仅用于制备平板）
去离子水			950 mL
氯化钠	Fisher	S640-3	20 g
胰蛋白胨	Fisher	BP97265	10 g
酵母提取物	Fisher	BP9727-2	5 g
<strong>mPBS（海水 PBS）</strong>			添加了海水盐的磷酸盐缓冲液；用于制备琼脂糖垫
10X PBS	Fisher	ICN1960454
Instant Ocean 海盐	Instant Ocean	SS1-160P	调整浓度至适当盐度；本实验使用 20 psu
无菌真空过滤装置	Fisher	SCGVU01RE	用于过滤除菌 mPBS
真空泵			用于过滤除菌 mPBS