增强型发光均相邻近分析：一种基于微珠的邻近分析方法用于筛选抑制蛋白质-蛋白质相互作用的小分子

摘要

来源：Wang, L. 等，利用均相珠基检测法研究分子伴侣-共伴侣相互作用。J. Vis. Exp. (2021)

在本视频中，我们演示了放大化学发光均相邻近检测——一种基于微珠的邻近检测方法。该方法利用大小均一的受体微珠和供体微珠，将两种倾向于相互作用的蛋白质固定在微珠上，用于筛选可能抑制蛋白质相互作用的小分子化合物。

方案

注意：本实验方案的概述见图1。

1. GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达与纯化（图 1A）

1. 质粒
   注意：从 IMAGE 联盟获取人源 FKBP51（克隆编号：5723416）和人源 FKBP52（克隆编号：7474554）的 cDNA 克隆。
   1. 使用含有 BamHI 和 XhoI 突出末端的引物（正向引物：5`GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3`，反向引物：5`-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3`）通过 PCR 扩增人源 FKBP51 DNA，并将其克隆至 pGEX6-1 载体的 BamHI / XhoI 限制性酶切位点。
   2. 使用含有 EcoRI 和 XhoI 突出末端的引物（正向引物：5`-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3`，反向引物：5`-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3`）通过 PCR 扩增人源 FKBP52 DNA，并将其克隆至 pGEX6-2 载体的 EcoRI / XhoI 限制性酶切位点。
      注意：PCR 反应体系及反应条件见表 1和表 2。
   3. 验证插入序列的正确性，并按照制造商说明书将质粒转化至化学感受态E. coli中。
2. 蛋白表达与纯化
   1. 将 25 g 胰蛋白胨（Luria broth，LB）基础培养基溶于 1 L 去离子水中配制 LB 溶液，121 °C 高压灭菌 15 分钟。冷却后加入氨苄青霉素至终浓度为 50 µg/mL。
   2. 挑取表达 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 的单菌落，加入 1.5 mL 离心管中的 500 µL LB 溶液中，涡旋混匀。
   3. 将步骤“1.2.2”的混合液转移至用铝箔封口的锥形瓶中的 1 L LB 溶液中。于 37 °C 摇床中过夜培养。
   4. 加入 1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，继续孵育 2 小时。
   5. 以 5,000 x g 离心 15 分钟收集菌体沉淀，弃去上清液。
      注意：菌体沉淀可在 -20 °C 保存。
   6. 将菌体沉淀重悬于 40 mL PBS 中，冰上超声处理 3 次，每次 20 秒。加入 1 mM PMSF、1 mM EDTA 和蛋白酶抑制剂混合物（1 片）以防止蛋白降解。
   7. 将悬液于 50,000 x g 离心 30 分钟以去除细胞碎片，将上清液上样至 5 mL GST-trap 柱。
   8. 用 30 mL PBS 洗涤层析柱后，使用含 10 mM 谷胱甘肽的 PBS 溶液 5 mL 洗脱 GST-FKBP51 和 GST-FKBP52。
   9. 使用 15 mL 10,000 MWCO 超滤离心装置浓缩蛋白。为去除游离谷胱甘肽，将浓缩液通过以 0.5x PBS 平衡的 PD-10 脱盐柱，并再次使用超滤装置浓缩。
   10. 收集含蛋白的洗脱组分，通过 SDS-PAGE 验证蛋白，并将蛋白浓度调整至 1 mg/mL。
       注意：典型蛋白产量为每升培养液 2–5 mg。蛋白可在 -20 °C 保存。

2. Hsp90 C端肽段与受体珠的偶联（图1B）

1. Hsp90 肽段制备
   1. 通过多肽合成服务合成人 Hsp90 β 亚型（UniProt ID: P08238）第 714–724 位氨基酸对应的十肽 NH₂-EDASRMEEVD-COOH。
   2. 用 PBS 将 Hsp90 肽段稀释至 1 mg/mL 浓度。
2. 受体珠制备
   1. 用 PBS 将未偶联的受体珠稀释至 1 mg/mL 浓度，并转移至 1.5 mL 离心管中。
   2. 在 16,000 × g 条件下离心 15 分钟进行洗涤，小心移除上清液。
3. 偶联反应
   1. 设定珠子与肽段的质量比为 10:1。在含有 1 mg 受体珠沉淀（按上述方法制备）的 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL PBS（pH 7.4）、0.1 mg 稀释后的肽段、1.25 µL Tween-20 和 10 µL 水中配制的 400 mM 氰基硼氢化钠（NaBH₃CN）溶液。
      注意：NaBH₃CN 具有毒性，需在通风橱中操作并佩戴手套；NaBH₃CN 溶液应新鲜配制。
   2. 在旋转摇床中于 37 °C 以末端翻转方式（10–20 rpm）孵育 24 小时。
4. 反应终止与珠子洗涤
   1. 向反应体系中加入 20 µL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）溶液以封闭未反应位点，在 37 °C 孵育 1 小时。
   2. 在 4 °C 条件下以 16,000 × g（或最大转速）离心 15 分钟，弃去上清液，将珠子沉淀重悬于 1 mL Tris-HCl 溶液（100 mM，pH 8.0）中。
   3. 重复洗涤步骤三次。
   4. 最后一次离心后，将珠子以 1 mg/mL 浓度重悬于储存缓冲液中（含 0.01% 叠氮化钠作为防腐剂的 0.5 × PBS 1 mL），并将偶联后的受体珠溶液置于 4 °C 避光保存。
      注意：叠氮化钠具有毒性，需在通风橱中操作并佩戴手套。

3. 探测GST-FKBP51或GST-FKBP52与Hsp90 C端肽段相互作用的实验，以及小分子化合物的抑制作用（图1C）

1. 与谷胱甘肽供体微珠相互作用的GST标签蛋白
   1. 在384孔板中设置反应体系。
   2. 配制含有10 µg/mL谷胱甘肽供体微珠的溶液，溶剂为0.5× PBS，pH 7.4。
      注意：长期储存后微珠可能发生沉淀，使用前需涡旋混匀。
   3. 加入GST-FKBP51或GST-FKBP52，使其终浓度为10 µg/mL。
   4. 在25 °C避光孵育10分钟。
      注意：此步骤中，GST标签蛋白将与连接在微珠上的谷胱甘肽发生结合。每孔使用22.5 µL该混合液。结合配体的浓度需通过实验确定。对GST-FKBP51和GST-FKBP52进行滴定，选择可获得最佳信号的浓度。
2. 化合物添加
   1. 将待测化合物用DMSO进行系列稀释。
      注意：通常使用的浓度为10、30、100、300、1,000和3,000 µM。
   2. 向每孔板的边缘加入0.25 µL DMSO（阴性对照）或Hsp90 C端肽（阳性对照，30 µM）或含化合物的DMSO溶液。每个化合物浓度设三个复孔。
   3. 向每孔加入22.5 µL含谷胱甘肽供体微珠及GST标签蛋白的溶液。
   4. 轻轻手动振荡混匀，确保充分混合。在25 °C避光孵育15分钟。
      注意：在此期间，化合物将与Hsp90 C端肽结合位点处的TPR结构域发生相互作用。
3. 受体微珠添加
   1. 将连接有Hsp90 C端肽的受体微珠用0.5× PBS稀释至100 µg/mL。
   2. 向每孔加入2.25 µL稀释后的受体微珠。
   3. 轻轻但充分混匀。在25 °C避光孵育15分钟。
      注意：此步骤中，供体微珠与受体微珠通过蛋白-肽相互作用被拉近至邻近位置。反应体系终体积为25 µL，因此化合物的终浓度范围为0.1至30 µM。
4. 读板
   注意：使用酶标仪，在相应检测模式下读取数据。
   1. 开启仪器并打开软件。
   2. 选择相应的检测程序。
   3. 点击 编辑板图，并选择用于检测的孔位。
   4. 点击 下一步 继续，并 运行 所选程序。
   5. 检测完成后，点击 显示结果 查看结果。
   6. 导出数据。

表1：人FKBP51和FKBP52 DNA扩增的PCR反应体系设置。

反应组分	体积 (µL)
PCR 缓冲液（5 倍浓缩液）	4
正向引物	1
反向引物	1
质粒	0.5
dNTP 混合液（各 10 mM）	0.5
Phusion DNA 聚合酶	0.5
水（DNA 级）	12.5
总计	20

表2：人源FKBP51和FKBP52 DNA扩增的PCR仪反应条件。

阶段	温度 (°C)	时间	循环次数
初始变性	94	3 分钟	1
变性	94	30 秒	35
退火	56	30 秒
延伸	72	1 分钟
最终延伸	72	5 分钟	1
注：盖子温度为 105 °C。

结果

图1：本实验方案的示意图。 （A）GST-FKBP51 和 GST-FKBP52 的表达与纯化。（B）将 Hsp90 C端肽偶联至受体珠。（C）检测 GST-FKBP51 或 GST-FKBP52 与 Hsp90 C端肽之间相互作用的实验体系。小分子化合物的抑制作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
384孔板	Perkin Elmer	6008350	检测体积 25 ml
Amicon 10,000 MWCO 离心浓缩管	Millipore	UFC901008	浓缩蛋白
氨苄青霉素	Sigma	A0166	抗生素
细菌摇床 Unimax 1010	Heidolph		培养细菌
人 FKBP51 的 cDNA 克隆	Source BioScience	克隆编号：5723416	pCMV-SPORT6 载体
人 FKBP52 的 cDNA 克隆	Source BioScience	克隆编号：7474554	pCMV-SPORT6 载体
化学感受态 E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
DMSO	Supelco	1.02952.1000	稀释化合物
DPBS	Gibco	14190-144	配制溶液
EDTA	Calbiochem	344504	超声过程中防止蛋白降解
谷胱甘肽	Sigma	G-4251	洗脱 GST 标签蛋白
谷胱甘肽供体微珠	Perkin Elmer	6765300	供体微珠
GST-trap 柱	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	纯化 GST 标签蛋白
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷	Thermo Fisher Scientific	R0392	诱导蛋白表达
LB 肉汤（Miller 型）	Sigma	L3522	微生物培养基
PCR 仪	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	扩增/PCR
PD-10 柱	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	溶液置换
pGEX-6P-1 载体	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	质粒
pGEX-6P-2 载体	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	质粒
酶标仪	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	读取 Alpha 板
酶标仪软件	Perkin Elmer	EnSpire Manager	酶标仪软件
酶标仪软件程序	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	使用该程序读取微孔板
PMSF	Sigma	P7626	超声过程中防止蛋白降解
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	S8830	超声过程中防止蛋白降解
叠氮化钠	Sigma	S2002	作为防腐剂
氰基硼氢化钠 (NaBH3CN)	Sigma	156159	活化基质用于偶联
对应人 Hsp90 β 亚型第 714-724 位氨基酸的十肽 NH2-EDASRMEEVD-COOH	Peptide 2.0 inc		合成 Hsp90 C 末端肽
试管旋转仪	LABINCO		实现翻转振荡
Tris-HCl	Sigma	10708976001	封闭受体微珠上的未反应位点
Tween-20	Sigma	P1379	防止微珠聚集
超速离心机 Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		离心获得细菌菌体沉淀
超声细胞破碎仪	Microson		超声破碎细胞以释放蛋白
未偶联受体微珠	Perkin Elmer	6762003	受体微珠
XCell SureLock Mini-Cell 和 XCell II 转印模块	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE