病毒蚀斑实验：通过定量病毒感染细胞单层中形成的蚀斑来测定单纯疱疹病毒的感染性

摘要

来源：Sadowski, L. A. 等. 单纯疱疹病毒的蚀斑实验. 视频实验杂志 (2021)

本视频介绍了感染性单纯疱疹病毒（HSV）的病毒蚀斑测定方法。将稀释后的病毒颗粒接种至上皮细胞单层，经孵育后，病毒形成肉眼可见的蚀斑，通过直接计数蚀斑数量以确定感染性病毒滴度。

方案

1. Vero 细胞的接种

1. 在开始进行蚀斑试验的前一天，用胰蛋白酶消化Vero细胞，并将其重悬于常规的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，按照标准细胞培养方法添加补充物。将消化后的细胞以每T-75培养瓶融合的Vero细胞（约10⁷个细胞）加入10 mL DMEM进行重悬。
   注意：蚀斑试验使用DMEM而非α-MEM，因为DMEM可略微减缓细胞生长速度，有利于获得更佳的蚀斑试验结果。
2. 采用研究者偏好的方法对细胞进行计数（例如，使用台盼蓝排斥法的标准血细胞计数板）。
3. 以每孔4 × 10⁶个细胞的密度接种细胞；对于HSV-2，使用6孔板，每孔加入2.5 mL DMEM（含补充物）；对于HSV-1，使用12孔板，每孔加入1.25 mL DMEM（含补充物）。
   注意：无论使用何种培养板，接种的细胞数量应保持恒定，但孔的尺寸会影响蚀斑试验的准确性。确保细胞均匀分布至关重要，最有效的方法是前后摇动培养板，而非以旋转方式晃动。
4. 将细胞置于加湿的培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下培养过夜。
   注意：培养箱内的湿度通过在底部放置含有除藻剂的蒸馏水盘来维持。

2. 样品稀释

1. 在一个实验环节内完成样品稀释以及将病毒加入细胞的操作。
   注意：HSV-1 和 HSV-2 对人类具有传染性，必须在适当的生物安全条件下（BSL-2）操作。所有与病毒接触的材料应单独存放，并在从生物安全柜中移出前，使用1/256稀释的季铵盐类消毒剂（参见材料表）、碘伏、漂白剂或强离子型去污剂（如SDS）进行消毒。
2. 在Vero细胞接种后的第二天，用1×PBS对每种待进行蚀斑分析的病毒样品进行系列稀释；通常采用10倍梯度稀释，以便最精确地追踪。
3. 根据病毒浓度情况，将样品稀释至10^-4 （病毒浓度较低时）或10^-9 （预期样品滴度较高时），并确保每个样品至少保留1 mL用于蚀斑实验本身。
4. 将所有病毒稀释液置于冰上保存（不超过1小时），待准备将稀释后的病毒样品加入细胞时再取出使用。

3. 将病毒加入细胞

1. 用移液器从一至两个孔中移除细胞培养基。
   注意：请勿使用抽吸装置，因其会过度移除细胞单层上的液体，导致细胞干燥。一个关键注意事项是确保在整个实验过程中细胞单层始终保持湿润。若细胞干燥，将在最后步骤中从培养板上脱落，从而产生无法使用的数据。因此，每次仅处理一至两个孔，以降低此风险。
2. 将稀释后的病毒样品（6孔板每孔使用100–400 µL，12孔板每孔使用50–200 µL）沿孔壁逐滴加入每个细胞单层中。重复此操作，每次处理一至两个孔，直至整块培养板的所有孔均加入待进行蚀斑的病毒样品。
   注意：若将液滴滴加至孔中央，可能会意外使细胞从基质上脱落。
3. 用手轻轻摇动整块培养板，确保含有病毒的PBS覆盖每个孔中的全部细胞单层，随后将培养板置于37 °C的CO₂培养箱中，使病毒吸附。
4. 在1小时内每隔10分钟将培养板从培养箱中取出，再次轻轻摇动以使病毒在各孔中分布更均匀，然后放回培养箱。
   注意：每个实验所需的重复次数及所用稀释度由实验设计决定，由读者自行确定。
5. 为降低意外计数未吸附接种物的可能性，使用1000 µL移液器吸头将病毒样品从孔中移除，并放入废液杯中。
   注意：同样，此操作每次仅处理一至两个孔，以维持细胞单层的湿润状态。
6. 向每孔加入2.5 mL甲基纤维素覆盖层（将5% w/w甲基纤维素溶于100 mL PBS中，于121 °C、15 psi条件下液体循环灭菌15分钟，然后加入375 mL DMEM和25 mL FBS）。
7. 当整块培养板均加入覆盖层后，将培养板放回培养箱中，继续培养两天。
   注意：若病毒与细胞在DMEM加补充物条件下培养三天，可能导致细胞单层出现显著脱落，从而影响最终数据的可靠性。
8. 在将废液杯移出生物安全柜前，通常需加入漂白剂、碘伏或其他类似病毒灭活剂对其进行消毒处理。

4. 斑块染色

1. 经过两天的孵育后，用移液器逐次吸取一到两个孔中的甲基纤维素覆盖层，并将其放入废液杯中。
2. 向每个孔中加入约 2 mL 含 50% 乙醇的 1% 结晶紫溶液（参见材料表），以对噬斑进行染色。
   注意：无需彻底移除覆盖层中的每一滴液体。
3. 将所有孔均加满染色液的培养板在 37 °C 下孵育 30 分钟。此时，按照步骤 3.8的方法对废液杯进行消毒处理。
4. 用自来水强力冲洗培养板，直至流出液清澈为止。
   注意：水流过弱不足以有效清洗；必须使用实验室水槽装置的全水压冲洗。
5. 此时应确认，每个稀释梯度系列之间的噬斑数量差异约为 10 倍。
6. 将培养板倒置过夜晾干，之后即可对单个噬斑进行计数。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12孔板	Corning	3512
6孔板	Corning	3516
Alpha-MEM	Lonza	12169F
抗生素/抗真菌剂	Gibco	15240096
结晶紫	Alfa Aesar	B2193214
DMEM	Gibco	11965092
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（不含 Mg++ 或 Ca++）	Gibco	14190144
胎牛血清	Millipore-Sigma	TMS-013-B
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（Glutamax）	Gibco	GS07F161BA
血细胞计数板	Thermo Fisher	02-671-54
甲基纤维素	Millipore-Sigma	27-441-0
季铵盐类消毒剂（Lysol I.C.）	Thermo Fisher	NC9645698
台盼蓝	Corning	25900CI
胰蛋白酶	Cytiva	SH30042.01
Vero 细胞	ATCC	CCL-81