末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记——TUNEL检测：一种原位检测凋亡细胞中DNA片段化的方法

摘要

来源：Brannelly, L. A.，等。利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Caspase 3/7检测法测定患壶菌病青蛙表皮细胞死亡。J. Vis. Exp. （2018）。

在本视频中，通过TUNEL实验检测样品中凋亡细胞的存在。该研究使用一种特殊的DNA聚合酶——末端脱氧核苷酸转移酶，该酶可催化标记的dUTP添加到断裂DNA的3'末端，随后可在荧光显微镜下观察并识别。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. TUNEL 检测

1. 对出现壶菌病临床症状的动物以及等量的Bd阴性对照动物实施安乐死。
2. 从每只动物身上解剖采集皮肤样本（背部、腹部和大腿部位），并将皮肤样本在4%（v/v）磷酸盐缓冲甲醛中固定2小时。较短且一致的固定时间可确保组织充分固定，同时有利于进行有效且准确的免疫组织化学染色。随后将样本转移至80%乙醇中，直至包埋切片。
3. 按照标准方法将皮肤组织进行石蜡包埋以制备组织学样本。简要步骤如下：
   1. 使用梯度乙醇对组织进行脱水，并用二甲苯清除乙醇；将组织包埋于石蜡中，并将每只个体的三份皮肤样本置于同一石蜡块内。
4. 按照标准组织学方法使用切片机对皮肤组织进行切片。连续切片厚度为5 µm，然后将切片贴附于亲水性玻璃载玻片上。每张载玻片上每种皮肤类型贴附四张连续组织切片。每只个体制作三张载玻片，每张载玻片均含有四种组织的连续切片，共四张切片。
5. 按以下顺序对载玻片进行染色：
   1. 第一张载玻片使用苏木精染色，随后进行伊红复染（H&E）。该载玻片用于观察Bd孢子囊在皮肤中的位置。
   2. 第二张载玻片采用 commercially available TUNEL 检测试剂盒进行染色，具体操作遵循制造商说明，步骤如下：
      1. 首先，在染色缸（coplin jar）中通过三次更换二甲苯（每次5分钟）对组织切片进行脱蜡，随后用两次100%乙醇（每次5分钟）清洗。接着用95%乙醇清洗一次（3分钟），再用70%乙醇清洗一次（3分钟）。最后用PBS清洗一次（5分钟）。
      2. 使用新配制的蛋白消化酶（蛋白酶K，浓度为20 μg/mL，溶于PBS）对组织进行预处理，并直接加至载玻片上，室温孵育15分钟。随后在染色缸中用两次PBS清洗，每次2分钟。
      3. 轻拍去除多余液体，然后在PBS中加入3.0%过氧化氢进行淬灭处理，在染色缸中室温孵育2分钟。再用PBS清洗两次，每次5分钟。
      4. 轻拍去除多余液体，然后直接在载玻片组织上加入75 µL/5 cm²平衡缓冲液，孵育10秒。轻拍去除切片周围多余液体后，加入55 µL/5 cm²工作浓度的末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）酶。在湿润孵育盒中37 °C孵育1小时。
      5. TdT酶孵育结束后，将载玻片放入含有工作浓度终止/洗涤缓冲液的染色缸中，振荡15秒，室温孵育10分钟。用PBS更换三次，每次1分钟。轻拍去除多余液体。
      6. 将已恢复至室温的抗地高辛标记偶联物（罗丹明）加至组织上，用量为65 µL/5 cm²。在湿润孵育盒中室温避光孵育30分钟。用PBS更换四次，每次2分钟。轻拍去除多余液体。
      7. 最后，在载玻片上加入15 µL含0.5 - 1 µg/mL DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的封片介质，作为复染剂。加盖盖玻片，并用指甲油或橡胶胶水密封。由于该检测对光敏感，需将载玻片置于暗处干燥。
   3. 第三张载玻片同样使用TUNEL检测并辅以DAPI复染，但每份样本均需设置阳性对照和阴性对照。
      注意：在对照载玻片上的4张组织切片中，前2张为阳性对照重复，后2张为阴性对照重复。
      1. 对于阳性对照，在步骤1.5.2.2之前，改用DN缓冲液（30 mM Trizma碱，pH 7.2，4 mM MgCl₂，0.1 mM DTT）预处理组织，室温孵育5分钟。然后将DNase I溶于DN缓冲液中，终浓度为0.1 µg/mL，并直接加至载玻片上，室温孵育15分钟。  随后用去离子水（dH₂O）清洗五次，每次3分钟。吸去多余液体后，继续按照第1.5.2.3节所述步骤进行TUNEL检测。
      2. 对于阴性对照，在相应样本中不添加末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）酶（如第1.5.2.4节所述）。

2. 完成检测后立即观察TUNEL切片。

1. 使用荧光显微镜，在200倍放大下，对每块皮肤切片随机选取多个区域拍照，分别使用罗丹明染料的滤光片（显示凋亡细胞，呈红色）和DAPI滤光片（显示所有细胞核，呈蓝色），以便生成细胞叠加图像。确保每个样本的每块皮肤切片至少拍摄100个细胞。将载玻片存放在-20 °C的避光显微镜盒中。
2. 对每张图像中的细胞（蓝色DAPI染色）进行计数。确保每块皮肤切片至少计数100个细胞。若单张图像中细胞数不足100个，则继续计数另一张图像，直至每个动物每块皮肤切片达到至少100个细胞。
3. 接着，在相同图像中计数TUNEL阳性细胞的数量（红色罗丹明染色）。TUNEL阳性细胞指示细胞凋亡，而非坏死或背景信号，其特征为单个细胞，细胞边界清晰（细胞膜完整，无裂解现象）。有时细胞会收缩形成凋亡小体。
4. 定位TUNEL检测中已计数的区域，并分析相应H&E染色组织切片上的对应区域。确认H&E染色切片中的区域对应于Bd感染部位，以确保在TUNEL检测中计数凋亡细胞时使用的是Bd感染位点。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
POLARstar Omega	BMG Labtech		化学发光酶标仪
384孔平底透明板	Corning	3707
384孔低缘白色平底板	Corning	3570
10% 中性缓冲福尔马林 Formal-Fixx	Fisher	6764254
ApopTag 红色原位细胞凋亡检测试剂盒	Merck Millipore	S7165
PBS（磷酸盐缓冲液），  pH 7.2 (1X)	Thermo/Life	20-012-043
Parafilm 封口膜	Bemis	PM996
乙醇，200 证明，分子生物学级	Fisher	BP2818500
ZEISS Axio Scan 荧光显微镜	Carl Zeiss		荧光显微镜
细胞培养培养皿	Nunc	263991