末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记——TUNEL检测：一种原位检测凋亡细胞中DNA片段化的方法

摘要

来源：Brannelly, L. A.，等。利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Caspase 3/7检测法测定患壶菌病青蛙表皮细胞死亡。J. Vis. Exp. （2018）。

在本视频中，通过TUNEL实验检测样品中凋亡细胞的存在。该研究使用一种特殊的DNA聚合酶——末端脱氧核苷酸转移酶，该酶可催化标记的dUTP添加到断裂DNA的3'末端，随后可在荧光显微镜下观察并识别。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. TUNEL 检测

1. 对出现壶菌病临床症状的动物以及等量的Bd阴性对照动物实施安乐死。
2. 从每只动物身上解剖采集皮肤样本（背部、腹部和大腿部位），并将皮肤样本在4%（v/v）磷酸盐缓冲甲醛中固定2小时。较短且一致的固定时间可确保组织充分固定，同时有利于进行有效且准确的免疫组织化学染色。随后将样本转移至80%乙醇中，直至包埋切片。
3. 按照标准方法将皮肤组织进行石蜡包埋以制备组织学样本。简要步骤如下：
   1. 使用梯度乙醇对组织进行脱水，并用二甲苯清除乙醇；将组织包埋于石蜡中，并将每只个体的三份皮肤样本置于同一石蜡块内。
4. 按照标准组织学方法使用切片机对皮肤组织进行切片。连续切片厚度为5 µm，然后将切片贴附于亲水性玻璃载玻片上。每张载玻片上每种皮肤类型贴附四张连续组织切片。每只个体制作三张载玻片，每张载玻片均含有四种组织的连续切片，共四张切片。
5. 按以下顺序对载玻片进行染色：
   1. 第一张载玻片使用苏木精染色，随后进行伊红复染（H&E）。该载玻片用于观察Bd孢子囊在皮肤中的位置。
   2. 第二张载玻片采用 commercially available TUNEL 检测试剂盒进行染....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
POLARstar Omega	BMG Labtech		化学发光酶标仪
384孔平底透明板	Corning	3707
384孔低缘白色平底板	Corning	3570
10% 中性缓冲福尔马林 Formal-Fixx	Fisher	6764254
ApopTag 红色原位细胞凋亡检测试剂盒	Merck Millipore	S7165
PBS（磷酸盐缓冲液），  pH 7.2 (1X)	Thermo/Life	20-012-043
Parafilm 封口膜	Bemis	PM996
乙醇，200 证明，分子生物学级	Fisher	BP2818500
ZEISS Axio Scan 荧光显微镜	Carl Zeiss		荧光显微镜
细胞培养培养皿	Nunc	263991