Caspase-3/7 检测：一种基于发光法的检测技术，通过测定青蛙皮肤外植体中 Caspase-3/7 活性来定量凋亡

摘要

来源：Brannelly, L. A. 等，利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Caspase 3/7检测法测定患壶菌病青蛙表皮细胞死亡。J. Vis. Exp. （2018）。

本视频介绍了一种 体外 用于定量细胞死亡或凋亡的 Caspase-3/7 发光检测试剂盒。该检测通过 Caspase-3/7 对发光型 DEVD 底物的切割作用产生发光信号，所生成的发光强度与 Caspase-3/7 活性成正比。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物饲养与监测

1. 将动物单独饲养，提供适合该物种的环境，并制定适当的供水、喂食和清洁计划。每天检查动物状况。
   1. 使用来自圈养繁殖设施捐赠的濒危物种Litoria verreauxii alpina成体个体（用于Caspase 3/7检测，第4节）。将动物维持在15–18 °C环境中，底材使用苔藓和碎石，每日用反渗透水喷雾保湿，每周喂食三次肠道富集的蟋蟀。
2. 每周对每只个体采集一次数据。按照步骤2.1所述方法对个体进行Bd拭子采样。使用天平称量每只动物体重，精确至0.1 g，并使用数显卡尺测量其吻肛长（SVL），精确至0.01 mm。
3. 接种后（如第3节所述），应每天检查动物是否出现感染的临床症状（皮肤异常脱落、食欲减退、腿部发红、精神萎靡或翻正反射延迟），并遵守动物伦理指南。若动物出现临床症状和明显病态，应实施安乐死。
   1. 使用过量三卡因甲磺酸盐（MS222）实施安乐死（在陈化自来水中配制0.1% w/v MS222溶液，用碳酸氢钠调节pH至6–7）。在动物所有活动停止且对外界刺激无反应....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
POLARstar Omega	BMG Labtech		发光酶标仪
384孔平底透明板	Corning	3707
384孔低环白色平底板	Corning	3570
细菌用琼脂（Oxoid）	Fisher	OXLP0011B
乳糖肉汤（Oxoid）	Fisher	OXCM0137B
碳酸氢钠	Fisher	BP328-500
Tricane-S（MS-222）	Fisher	NC0872873
胰蛋白胨	Fisher	BP1421-500
牛血清白蛋白	Invitrogen	15561020
无菌人造丝拭子	Medical Wire & Equipment	MW-113
考马斯亮蓝 Bradford 试剂	Pierce	23200
Caspase Glo 3/7	Promega	G8090
HEPES 缓冲液	Sigma-Aldrich	H0887-20ML
氯化镁	Sigma-Aldrich	1374248-1G
酶解明胶水解物	Sigma-Aldrich	G0262
PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.2（1X）	Thermo/Life	20-012-043
Prepman	Thermo/Life	4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444556
Clorox 漂白剂	Clorox
乙醇，200 证明，分子级	Fisher	BP2818500
ZEISS Axio Scan 荧光显微镜	Carl Zeiss		荧光显微镜
3.2 mm 不锈钢珠	BioSpec	11079132SS
引物 ITSI-3 Chytr（5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′）	Taqman		引物和探针的个性化设计
引物 5.8S Chytr（5′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3′）	Taqman		引物和探针的个性化设计
小沟结合探针 Chytr MGB2（5′-CGAGTCGAAC-3′）	Taqman		引物和探针的个性化设计
Rotor-Gene qPCR 仪器	Qiagen		qPCR 仪
微量离心管 1.5 ml	Fisher	02-681-372
细胞培养培养皿	Nunc	263991
Mini-beadBeater 锆硅酸盐珠，0.5 mm	BioSpec	11079105Z