Caspase-3/7 检测：一种基于发光法的检测技术，通过测定青蛙皮肤外植体中 Caspase-3/7 活性来定量凋亡

摘要

来源：Brannelly, L. A. 等，利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）和Caspase 3/7检测法测定患壶菌病青蛙表皮细胞死亡。J. Vis. Exp. （2018）。

本视频介绍了一种 体外 用于定量细胞死亡或凋亡的 Caspase-3/7 发光检测试剂盒。该检测通过 Caspase-3/7 对发光型 DEVD 底物的切割作用产生发光信号，所生成的发光强度与 Caspase-3/7 活性成正比。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 动物饲养与监测

1. 将动物单独饲养，提供适合该物种的环境，并制定适当的供水、喂食和清洁计划。每天检查动物状况。
   1. 使用来自圈养繁殖设施捐赠的濒危物种Litoria verreauxii alpina成体个体（用于Caspase 3/7检测，第4节）。将动物维持在15–18 °C环境中，底材使用苔藓和碎石，每日用反渗透水喷雾保湿，每周喂食三次肠道富集的蟋蟀。
2. 每周对每只个体采集一次数据。按照步骤2.1所述方法对个体进行Bd拭子采样。使用天平称量每只动物体重，精确至0.1 g，并使用数显卡尺测量其吻肛长（SVL），精确至0.01 mm。
3. 接种后（如第3节所述），应每天检查动物是否出现感染的临床症状（皮肤异常脱落、食欲减退、腿部发红、精神萎靡或翻正反射延迟），并遵守动物伦理指南。若动物出现临床症状和明显病态，应实施安乐死。
   1. 使用过量三卡因甲磺酸盐（MS222）实施安乐死（在陈化自来水中配制0.1% w/v MS222溶液，用碳酸氢钠调节pH至6–7）。在动物所有活动停止且对外界刺激无反应后，继续将其留在MS222溶液中10分钟。

2. 检测 Bd 感染

1. 对 Bd 进行拭子采样
   1. 使用新的无菌人造丝拭子对每只动物进行采样（每只动物使用一个拭子）。采样方法如下：腹部擦拭5次，每个大腿、体侧和四肢各擦拭5次。总计45次擦拭动作。
   2. 在擦拭过程中及每次擦拭之间轻轻旋转拭子，以确保有效捕获DNA。将拭子头折断放入1.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存直至提取DNA。
2. DNA提取与qPCR检测
   1. 通过向每个拭子样本中加入50 µL市售DNA提取试剂及30–40 mg 0.5 mm二氧化硅珠来提取基因组DNA。在珠磨仪细胞破碎仪中以最高速度震荡样品2分钟。珠磨处理后，以2,000 xg离心1分钟。
   2. 将样品在100 °C孵育10分钟，随后冷却。以5,000 x g离心3分钟，然后将上清液转移至单独的1.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存直至进行qPCR检测。
   3. 采用Boyle et al. 2004所述的定量PCR（qPCR）方法分析感染负荷，并作如下修改：
      1. 用双蒸水将DNA提取样本稀释6:100。每个孔中加入0.7 µL牛血清白蛋白（BSA），以帮助防止PCR抑制。每个样本设单孔重复。每块板上均设置阴性对照（无模板）和阳性对照，并使用一系列稀释标准品以估算游动孢子（感染）负荷。

3. 接种

1. 培养 Bd
   1. 通过将 16 g 胰蛋白胨、2 g 明胶水解物和 4 g 乳糖（TGHL）加入 1 L 去离子水中制备培养液。121 °C 高压灭菌 40 分钟，然后让培养液冷却。
   2. 将 Bd 分离株（本例中为来自新南威尔士州的分离株 AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1，传代次数为 11）接种至 TGHL 培养液中，在 23 °C 下培养 7 天，随后将液体培养物转移至 TGHL 琼脂平板上。
   3. 制备平板时，将 16 g 胰蛋白胨、2 g 明胶水解物、4 g 乳糖（TGHL）和 10 g 细菌学琼脂加入 1 L 去离子水中，121 °C 高压灭菌 40 分钟。待混合物冷却至可触碰但尚未凝固时，在 II 级生物安全柜中将 TGHL 琼脂倒入直径为 92 mm 的培养皿中，填充至 1/4 至 1/3 满。
   4. 待琼脂完全凝固并冷却后，每块平板接种 0.5 mL 来自液体培养液的 Bd，并均匀涂布。让 Bd 培养液混合物在平板上干燥约 1 小时，然后用塑料封口膜密封平板。将平板倒置，在 23 °C 下培养 5–7 天。
2. 制备游动孢子接种液的平板淹没
   1. 接种前每天在倒置光学显微镜下检查游动孢子的运动性以确保其活性。当游动孢子释放量高，大量游动孢子在孢子囊外游动时，表明培养物已准备好用于接种。
   2. 向每块平板中加入 3 mL 陈化自来水或人工池水，将水倒入平板后在室温下孵育 10 分钟，使游动孢子释放到水中。孵育结束后，将游动孢子悬液倾入新的无菌容器中。
   3. 按照血球计数板制造商的说明估算游动孢子浓度。确定游动孢子悬液浓度后，用陈化自来水将其稀释至每 3 mL 含 1 × 10⁶ 个游动孢子的浓度。
3. 接种动物
   1. 将 3 mL 接种液混合物倾倒于每只动物的腹面，置于独立的 50 mL 容器中进行接种。让多余的接种液积聚在接种容器底部。每只动物在独立的接种容器中放置 24 小时以确保感染成功。24 小时接种结束后，将每只个体转移回已消毒的饲养箱。
      1. 使用 13% 体积比（v/v）的市售漂白剂溶液对饲养箱进行消毒，用水至少冲洗两次，然后干燥不少于 24 小时。
   2. 对于 Bd 阴性对照组，采用与 3.2–3.3 相同的方法进行模拟接种，但使用 5 mL 陈化自来水淹没未接种 Bd 的琼脂平板，而非接种了 Bd 的琼脂平板。

4. Caspase 3/7 检测

1. 从每只动物（包括暴露于Bd和未感染Bd的个体）中每周采集一次脚趾尖样本，持续至接种后第3周，之后每两周采集一次，直至实验结束，每次最多采集8个脚趾尖。
   1. 使用火焰灭菌的剪刀在第二指节处剪下脚趾尖，放入1.5 mL微量离心管中，并立即在-80 °C下冷冻保存。
2. 从冷冻的脚趾样本中提取蛋白质。
   1. 将样本置于含有100 µL样品缓冲液（25 mM HEPES，pH 7，5 mM MgCl₂）的1.5 mL螺口微量离心管中，并加入两颗不锈钢珠（3.2 mm）。使用珠磨仪以最大速度进行4次每次1分钟的珠磨裂解（使用的珠磨仪与步骤1.2.1中相同），每次裂解后在冰上放置3分钟。裂解完成后，在4 °C下以12,000 x g离心5分钟。收集上清液用于后续检测。
3. 使用Bradford法测定每个样本的蛋白浓度。
   1. 在384孔板中，将10 µL蛋白提取物与10 µL Bradford试剂混合，在室温下孵育2分钟。每个样本设两个复孔，同时设置一系列5倍稀释的BSA标准品。使用吸光度酶标仪在595 nm处读取吸光值。
4. 如果脚趾尖样本过小（根据Bradford法测定蛋白浓度接近最低标准，或采样青蛙总重量低于3 g），可改用拍照估算皮肤表面积的方法对样本进行标准化处理，而非采用Bradford法。
   1. 在为caspase检测提取蛋白前，使用倒置光学显微镜以40倍放大倍数拍摄每个脚趾尖的照片。
   2. 使用计算机图像分析软件分析脚趾样本，通过估算脚趾面积进行计算。具体操作为在脚趾剪切样本边缘绘制轮廓线，由图像软件估算该轮廓内的面积，然后将该面积乘以π（3.14），从而近似得到三维皮肤样本的表面积（因为长度 × 横截面周长（π × 直径）等于管状结构的外表面积）。
5. 进行caspase 3/7活性检测。
   1. 在384孔发光检测板中，每孔加入10 µL commercially available caspase 3/7试剂和10 µL蛋白提取物。每个样本设三个复孔。
   2. 轻轻振荡酶标板15秒以混匀试剂。将酶标板避光于室温孵育30分钟。使用发光酶标仪测定发光信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
POLARstar Omega	BMG Labtech		发光酶标仪
384孔平底透明板	Corning	3707
384孔低环白色平底板	Corning	3570
细菌用琼脂（Oxoid）	Fisher	OXLP0011B
乳糖肉汤（Oxoid）	Fisher	OXCM0137B
碳酸氢钠	Fisher	BP328-500
Tricane-S（MS-222）	Fisher	NC0872873
胰蛋白胨	Fisher	BP1421-500
牛血清白蛋白	Invitrogen	15561020
无菌人造丝拭子	Medical Wire & Equipment	MW-113
考马斯亮蓝 Bradford 试剂	Pierce	23200
Caspase Glo 3/7	Promega	G8090
HEPES 缓冲液	Sigma-Aldrich	H0887-20ML
氯化镁	Sigma-Aldrich	1374248-1G
酶解明胶水解物	Sigma-Aldrich	G0262
PBS（磷酸盐缓冲液），pH 7.2（1X）	Thermo/Life	20-012-043
Prepman	Thermo/Life	4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix	ThermoFisher	4444556
Clorox 漂白剂	Clorox
乙醇，200 证明，分子级	Fisher	BP2818500
ZEISS Axio Scan 荧光显微镜	Carl Zeiss		荧光显微镜
3.2 mm 不锈钢珠	BioSpec	11079132SS
引物 ITSI-3 Chytr（5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′）	Taqman		引物和探针的个性化设计
引物 5.8S Chytr（5′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3′）	Taqman		引物和探针的个性化设计
小沟结合探针 Chytr MGB2（5′-CGAGTCGAAC-3′）	Taqman		引物和探针的个性化设计
Rotor-Gene qPCR 仪器	Qiagen		qPCR 仪
微量离心管 1.5 ml	Fisher	02-681-372
细胞培养培养皿	Nunc	263991
Mini-beadBeater 锆硅酸盐珠，0.5 mm	BioSpec	11079105Z